加味苓桂術(shù)甘方對酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織ADRP、PPAR-γ和Sir 2蛋白表達(dá)的影響*

晁　旭王越月杜　靜趙家榮安慶玲李磊磊

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西　咸陽712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽71200）

·研究報告·

加味苓桂術(shù)甘方對酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織ADRP、PPAR-γ和Sir 2蛋白表達(dá)的影響*

晁旭1，2王越月2杜靜2趙家榮1安慶玲1李磊磊1

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽71200）

目的研究加味苓桂術(shù)甘方對酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP）、過氧化物酶體增殖活化物受體γ（PPAR-γ）和沉默信息調(diào)控子2（Sir2）蛋白表達(dá)的影響。方法SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。50只給予含乙醇灌胃，同時飼喂高脂飼料，制備酒精性脂肪肝模型。實驗組動物給予不同劑量的加味苓桂術(shù)甘灌胃6周。然后采用生化分析儀檢測血樣中總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、脂肪酸（FFA）的含量；利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（Western blot）技術(shù)，檢測酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟組織中ADRP、PPAR-γ和Sir2的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，給藥6周后加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組大鼠血清中TG、CHOL和FFA水平均有明顯下降（P＜0.05）；加味苓桂術(shù)甘方可顯著下調(diào)肝臟組織中ADRP、PPAR-γ的表達(dá)，而上調(diào)Sir2的表達(dá)。結(jié)論加味苓桂術(shù)甘方可通過改變肝臟組織ADRP、PPAR-γ和Sir2的表達(dá)，從而抑制酒精性脂肪肝的發(fā)生。

酒精性脂肪加味苓桂術(shù)甘方ADRP PPAR-γSir2

【Abstract】Objective：To study effects of Jiawei Linggui Zhugan Decoction on expression of ADRP，PPAR-γ and Sir 2 protein in liver tissues in ratmodelwith alcoholic fatty liver.M ethods：60male SD ratswere random ly divided into 6 groups with 10 rats in each group.50 rats were fed with high fat diet and ethanol fed to establish the experimentalmodel of alcoholic fatty liver.The animals of the experimental group were treated with different doses of Jiawei Linggui Zhugan Decoction and ethanol gavage.The total cholesterol（CHOL），triglyceride（TG）and fatty acid（FFA）in blood of animalsweremeasured with biochemical analyzer.The expressions of ADRP，PPAR-γand Sir2 mRNA and proteins in liver tissues were analyzed through RT-PCR and western blot.Results：Compared with themodel group，the levels of TG，CHOL and FFA in serum of ratmodels，treated with Jiawei Linggui Zhugan Decoction with medium-dosage and the high for 6 weeks，were significantly lower（P＜0.05）.Jiawei Linggui Zhugan Decoction could significantly decrease the expression of ADRP，PPAR-γ，and up-regulated the expression of Sir 2 in liver tissue.Conclusion：Jiawei Linggui Zhugan Decoction can change the expression of ADRP，PPAR-γand Sir 2 in liver tissue，thereby inhibiting the occurrence of fatty liver.

【Key words】Alcoholic fatty liver；Jiawei Linggui Zhugan Decoction；ADRP；PPAR-γ；Sir2

酒精性脂肪肝（AFL）是指由于長期酒精攝入過量而導(dǎo)致的肝臟疾病［1］。隨著生活水平的提高，我國酒精性脂肪肝患者急劇增長［2］。AFL在早期是可以逆轉(zhuǎn)的，經(jīng)戒酒和治療后，肝損害可逐漸得以改善［3］。如果不及時治療，則演變?yōu)椴豢赡孓D(zhuǎn)肝纖維化［4］。因此，在積極戒酒之外尋找療效可靠的藥物就顯得尤為重要［5］。脂肪肝在中醫(yī)上歸屬于“脅痛”“肥氣”“肝著”“痰濁”“積聚”的范疇。嗜酒食肥甘厚味，傷及脾胃；加之久臥久坐，體豐痰盛，或情志失常，長期憂思郁怒，感受濕熱疫毒等，均可導(dǎo)致肝失疏泄，脾失健運(yùn)，水濕停聚，痰濁郁結(jié)，氣滯血瘀，最終形成濕痰瘀阻互結(jié)，痹阻肝臟脈絡(luò)而成。加味苓桂術(shù)甘方臨床用于治療酒精性脂肪肝，效果良好［6］，但對其具體的分子機(jī)理尚未見報道。本研究以酒精性脂肪肝大鼠模型為研究對象，通過RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測給藥前后動物肝臟組織中脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP）、過氧化物酶體增殖活化物受體γ（PPAR-γ）和沉默信息調(diào)控子2（Sir2）mR NA和蛋白的水平，從分子水平探討加味苓桂術(shù)甘方對酒精性脂肪肝治療作用的機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD雄性大鼠60只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體質(zhì)量（200±20）g，合格證號：2015A023，實驗室溫度控制在20℃～25℃，相對濕度50%～70%，光暗周期為12 h。

1.2藥物與試劑加味苓桂術(shù)甘方：山楂15 g，決明子10 g，茯苓12 g，澤瀉20 g，術(shù)10 g，桂枝10 g，荷葉10 g，甘草8 g，丹參15 g，姜黃10 g，桃仁10 g，川芎10 g，葛花10 g。所有藥材均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定。所有藥物稱量好后，加注射用水400 mL，煎煮20 min后，取濾液濃縮至75mL（2 g/mL），4℃冰箱保存、備用。Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司、二甲基亞硝胺及其他試劑購自Sigma-Aldrich（中國）公司、PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3分組與造模大鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組，模型對照組，加味苓桂術(shù)甘方小劑量組、加味苓桂術(shù)甘方中劑量組、加味苓桂術(shù)甘方大劑量組，陽性對照組，每組10只。實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常對照組動物飼喂正常飼料；另外50只實驗開始第1～3天按15mL/（kg·d）給予含乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%的白酒灌胃；第4天起按15mL/（kg·d）給予含乙醇體積分?jǐn)?shù)為52%的北京二鍋頭白酒灌胃。同時飼喂自制的富含脂肪的飼料（普通飼料與豬油比例為85∶15，硫酸亞鐵含量15 g/kg飼料），自由飲水，連續(xù)6周。

1.4給藥方法正常對照組動物飼喂普通飼料，自由進(jìn)食。模型對照組大鼠給予每日1次生理鹽水灌胃，每次4mL，自由進(jìn)食。加味苓桂術(shù)甘顆粒小、中、大劑量組分別給予質(zhì)量濃度為0.5、1、2 g/mL加味苓桂術(shù)甘湯灌胃，每次4mL，每日1次，自由進(jìn)食。陽性對照組，按20 mL/kg體質(zhì)量灌服美他多辛溶液，每日1次，自由進(jìn)食。連續(xù)給藥6周。

1.5標(biāo)本采集與檢測

1.5.1血脂含量檢測給藥結(jié)束后，動物禁食12 h，稱體質(zhì)量，取腹主動脈血液2mL，置于抗凝管內(nèi)。靜置2 h后，3000 r/min離心10min，取上清液得血清。按照血脂檢測試劑盒的明書操作，利用生化分析儀檢測血樣中總膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、脂肪酸（FFA）的含量。

1.5.2RT-PCR檢測肝臟組織ADRP、PPARγ和Sir2的mRNA水平給藥結(jié)束后，處死動物，取0.3 g肝組織，用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA分別按1、10、100和1000的倍數(shù)稀釋，然后按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒的說明，在ABI 7300 Real-time PCR儀（Applied Biosystems）進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)引物序列為：ADRP：5′-CTTGTGTCCTCCGCTTATGTCAGT-3′，5′-CTGCT CCTTTGGTCTTATCCACCA-3′；PPA-γ：5′-ATTCTGG CCCACCAACTTCGG-3′，5′-TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCCA-3′；Sir2：5′-TGGCGGAGAGGCAGAGATG GAC-3′，5′-GGCGGATGAAGTAGTGGCAGATGG-3′；β-actin：5′-CAGTAA CAGTCCGCCTAGAA-3′，5′-GA TTACTGCTCTGGCTCCTA-3′。反應(yīng)完后，計算各組樣品中mRNA的平均Ct值，再進(jìn)行歸一化處理，得到ΔΔ-Ct，最后用相對定量法（RQ=2-ΔΔCt）計算給藥前后各基因表達(dá)的差異。

1.5.3免疫印跡肝臟組織PPAR-γ、ADRP和Sir2蛋白表達(dá)所有動物連續(xù)給藥6周后處死，摘取全部肝臟，取100mg肝臟組織，用蛋白提取試劑盒提取肝臟組織的總蛋白。然后取含有100μg總蛋白的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST溶液封閉PVDF膜1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15min，二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15min，ECL顯影，暗室曝光。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以（表示，采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠血脂含量比較見表1。結(jié)果示，與正常組比較，造模6周后，模型對照組大鼠血清TG、CHOL和FFA水平均明顯升高；與模型對照組相比，給藥6周后加味苓桂術(shù)甘方中劑量和大劑量組大鼠血清中TG、CHOL和FFA水平均有明顯下降（P＜0.05）。2.2各組大鼠肝臟ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比較見表2。與正常對照組比較，造模6周的模型大鼠ADRP、PPAR-γmRNA表達(dá)明顯升高。給予中劑量和大劑量加味苓桂術(shù)甘方灌胃6周后，加味苓桂術(shù)甘方大中劑量組大鼠ADRP、PPAR-γmRNA表達(dá)顯著下降，Sir2mRNA的表達(dá)水平顯著上升。

表1　各組大鼠血清中TG、CHOL和FFA含量比較（mmol/L，

表1　各組大鼠血清中TG、CHOL和FFA含量比較（mmol/L，

與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n FFA正常對照組10 0.48±0.12**模型對照組10 1.38±0.47△△加味苓桂術(shù)甘方小劑量組10 1.23±0.47 TG CHOL 1.86±0.23*2.14±2.47*2.54±0.22△3.22±0.56△2.28±1.23 3.24±0.89加味苓桂術(shù)甘方中劑量組10 0.63±0.23*2.12±0.46*2.32±0.57*加味苓桂術(shù)甘方大劑量組10 1.94±0.76*2.21±0.76*0.52±0.25**陽性對照組10 1.88±0.49*2.18±0.48*0.51±0.24**

表2　各組大鼠肝臟ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比較（

表2　各組大鼠肝臟ADRP、PPAR-γ和Sir2mRNA水平比較（

組別n Sir2/β-actin正常對照組10 0.71±0.26**模型對照組10 0.38±0.19△加味苓桂術(shù)甘方小劑量組10 0.46±0.17 ADRP/β-actin PPAR-γ/β-actin 0.21±0.16*0.26±0.12*0.48±0.21△0.68±0.23△0.42±0.17 0.52±0.17加味苓桂術(shù)甘方中劑量組10 0.55±0.29*0.29±0.19*0.35±0.09*加味苓桂術(shù)甘方大劑量組10 0.23±0.28*0.32±0.17*0.62±0.27**陽性對照組10 0.22±0.11*0.29±0.11*0.69±0.21**

2.3各組大鼠肝臟ADRP、PPAR-γ和Sir2蛋白表達(dá)的影響見圖1。Western blot分析顯示，與正常對照組大鼠相比，造模6周后的AFL大鼠肝臟組織中ADRP和PPAR-γ蛋白表達(dá)水平明顯升高。模型組動物給予中劑量加味苓桂術(shù)甘方灌胃6周后，ADRP和PPAR-γ的蛋白表達(dá)有明顯下降，Sir2蛋白表達(dá)相對含量明顯高升高。

圖1　各組大鼠肝臟ADRP、PPAR-γ和Sir2蛋白表達(dá)

3　討　論

隨著我國人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，酒精消耗量也在逐年增加，AFL的發(fā)病率在我國亦逐年增高，女性每日酒精飲用量超過10～20 g，男性超過20～40 g即可形成［5］。AFL的發(fā)病機(jī)制可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟的損傷以及氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪細(xì)胞因子等因素有關(guān)［6-7］。脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP）是一種存在于靈長類脂肪細(xì)胞的相對分子量為48 KD的蛋白質(zhì)，是脂肪細(xì)胞早期分化及脂質(zhì)積聚的標(biāo)志［8-9］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類由配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子。PPARs是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪生成、胰島素敏感、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞生長和分化的重要因子［10］，長鏈脂肪酸可引起PPARγ信號傳導(dǎo)的異常，促進(jìn)ADRP的表達(dá)［11-12］。其中，PPAR-γ可刺激前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，PPAR-γ的高表達(dá)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪酸重新合成，引起脂質(zhì)蓄積［13］。沉默信息調(diào)控子2（Sir2）是一種高度保守，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性的組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶［14］。Sir2通過抑制PPAR-γ活性，從而調(diào)控甘油三酯在細(xì)胞中的積累，下調(diào)脂肪儲存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［15］。Sir2蛋白過度表達(dá)可減少脂肪形成，降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化積累，對Sir2進(jìn)行RNA干涉可以增加脂肪形成［16-17］。研究表明，在非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠體內(nèi)，Sir2表達(dá)明顯降低［18］。

加味苓桂術(shù)甘方是臨床上治療AFL的方劑，方中茯苓、澤瀉、蒼術(shù)健脾滲濕為君藥；桂枝通陽化氣，桃仁、紅花和姜黃活血行氣化瘀，川芎、赤芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，使肝氣條達(dá)，血脈通暢，為臣藥；山楂消食化積、散瘀行滯，決明子清肝明目，潤腸通便，為佐藥；葛花解酒醒脾。甘草調(diào)和諸藥為使藥。全方共奏化痰解毒，逐瘀化積之功。研究表明，加味苓桂術(shù)甘湯對代謝綜合征模型大鼠的血漿TC、TG升高有一定調(diào)節(jié)作用，并使之趨于正常［19］。

本研究結(jié)果顯示，酒精性脂肪肝大鼠灌胃加味苓桂術(shù)甘方6周后，ADRP、PPARγ的mRNA表達(dá)下降，而Sir2mRNA的表達(dá)升高。Western blot分析顯示，與模型對照組大鼠相比，加味苓桂術(shù)甘方給藥6周后AFL模型大鼠ADRP和PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯下降，Sir2蛋白表達(dá)水平明顯升高。綜上所述，加味苓桂術(shù)甘方對AFL大鼠有一定防治作用，其可能的作用機(jī)制是加味苓桂術(shù)甘方通過上調(diào)Sir2，從而進(jìn)一步抑制ADRP和PPAR-γ的表達(dá)，改善脂質(zhì)代謝紊亂作用，調(diào)節(jié)炎癥因子以及抗脂質(zhì)過氧化作用，從而抑制肝臟中脂肪的堆積。但有關(guān)加味苓桂術(shù)甘方對AFL脂質(zhì)代謝影響的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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E ffects of Jiawei Linggui Zhugan Decoction on Expression of ADRP，PPAR-γand Sir 2 Protein in Liver Tissues in Rat M odelw ith A lcoholic Fatty Liver

CHAO Xu，WANG Yueyue，DU Jing，et al.The College of Preclinical Sciences，ShaanxiUniversity of Chinese Medicine，Shaanxi，Xianyang 712046，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1663-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.006

2016-04-16）

陜西省咸陽市科技計劃項目（2014K04-02）