續斷水提液對小鼠脛骨骨折愈合影響的實驗研究*

武春明袁慧敏楊　迪劉　魏毛　矛

鄒斌杰1，2蘇　彪1，2胡偉龍1，2劉晉閩1，2

（1.浙江中醫藥大學，浙江　杭州310053；2.浙江省中醫院，浙江　杭州310006；3．浙江省人民醫院，浙江　杭州310014）

·研究報告·

續斷水提液對小鼠脛骨骨折愈合影響的實驗研究*

武春明1，2袁慧敏1，2楊迪3△劉魏1，2毛矛1，2

鄒斌杰1，2蘇彪1，2胡偉龍1，2劉晉閩1，2

（1.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫院，浙江杭州310006；3．浙江省人民醫院，浙江杭州310014）

目的觀察續斷水提液對小鼠脛骨橫行骨折愈合過程的影響。方法選用12周齡C57小鼠70只，無菌條件下實施脛骨干橫形骨折髓內釘固定術，脛骨X線正側位片剔除不合格小鼠，余下隨機分為模型組、治療組，每組再隨機分為5個不同時間點。治療組予續斷水提液灌胃，模型組給予同體積生理鹽水，分別于造模后第4天、7天、10天、14天、21天取樣，固定后X線觀察骨折愈合大體情況，Micro-CT測量ROI總體積（TV）、骨痂總體積（BV）、骨體積分數（BV/TV）和骨小梁相關參數，同時通過組織形態學HE染色評估續斷水提液對小鼠骨折愈合過程的形態學影響。結果X線顯示兩組在骨折愈合早期（4、7、10 d）兩組骨折線多較清晰，而在骨折愈合中后期（14、21 d）治療組骨折線模糊程度高于模型組（P＜0.05）；Micro-CT顯示兩組間BV、BV/TV、Tb.Pf和SMI在術后14 d、21 d差異均具有統計學意義（P＜0.05），而TS兩組間在各時間點差異均無統計學意義（均P＞0.05）；術后7 d和10 d時，骨痂多為軟組織，14 d和21 d則逐漸向骨性轉化。在術后14 d和21 d兩個時間點，治療組骨痂骨量明顯多于模型組，而且治療組骨痂的形狀也更為規則，與皮質骨貼合更為緊密。結論依據X線、Micro-CT及組織形態學HE染色發現續斷水提液可促進小鼠脛骨橫行骨折的愈合，且其作用時間點為小鼠骨折愈合中后期。

骨折Micro-CT續斷骨折

【A bstract】Objective：To explore the promoting effect of Radix Dipsaci extract on tibial fracture healing in mice.M ethods：12-week-old C57BL/6mouse were chosen for the experiment，and made a unilateral open tibiae transverse fracture with intramedullary needle fixationmodel.After the operation，They were divided into 2 groups for 5 time points random ly.The treatment group and themodel group were given Teasel rootextractand saline respectively.The samples were taken on 4th，7th，10th，14thand 21stday.3 days later，X-ray was used to observe the general situation of fracture healing，and the characteristics of bone volume of ROI（TV），volume of callus（BV），bone volume fraction（BV/TV）and Trabecular related indexes were detected with Micro-CT.At the same time，histological staining（HE）was used to assess themorphological effect of Radix Dipsaciextrac on fracture healing process ofmice.Results：X-ray showed that in the early fracture healing（4th，7th，10thday），most of fracture lines of two groupswere clear，but in the late stage of fracture healing（14th，21stday），the fuzzy degree of the treatment group was higher than that of themodel group.Micro-CT showed that there were statistical differences in BV，BV/ TV，Tb.Pf，and SMIbetween the treatment group and themodel group on 14thday and 21stday after the operation（P＜0.05）.TS showed no statistical differences among all time points.Morphological HE staining showed that 10th，14thand 21stday after operation，callus quantity，shape and direction of the treatment group were better than those of themodel group.Conclusion：Radix Dipsaci extract has a promoting effect on tibial fracture healing in mice and the promoting effect focuses on themiddle and late period.

【Key words】Fracture；Micro-CT；Radix Dipsaci

骨折是指骨的連續性與完整性被破壞，骨的機械性能超生理負荷的結果。近年來，骨折發生逐年上升［1］，骨不連、延遲愈合等骨折并發癥也顯著增多，嚴重威脅人們的健康和勞動能力［2］。因此，如何促進骨折愈合，縮短骨折愈合時間，減少患者并發癥的發生，是廣大創傷骨科醫生非常關心的問題之一。骨折愈合是一個復雜的生物學修復過程，而中醫藥在治療骨折方面歷史悠久、療效肯定，且方便易行、成本低廉、毒副作用低，已被廣泛運用于骨折治療中。本研究通過建立小鼠脛骨橫行骨折模型，運用X線、Micro-CT和組織形態方法觀察中藥續斷水提物對小鼠脛骨骨折愈合的影響。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康正常12周齡C57BL/6JSPF級小鼠70只，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：ACXK（滬）2013-0016，雌雄不拘，體質量20～25 g，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，所有小鼠均用標準的嚙齒類動物飼料喂養。實驗過程對動物的處置符合浙江中醫藥大學實驗動物倫理學標準。

1.2試藥與儀器續斷水提液的制備：稱取續斷（由浙江中醫藥大學藥廠提供），10倍超純水浸泡1 h后，大火煮沸后調小至微沸，以藥液剛好沸騰為宜，煎熬1.5 h，反復提取3次，3次藥液混合后經旋蒸儀（杭州大衛）濃縮至質量濃度0.45 g/mL后待用。戊巴比妥鈉，中國醫藥集團上海化學試劑公司生產，批號F20020915；青霉素，華北制藥股份有限公司生產，批號F3117217；絡合碘，杭州朗索醫用消毒劑有限公司生產，批號20150720。慶大霉素，宜昌人福藥業有限責任公司生產，批號：5150126C。組織脫水機，Sakura，Tissue-Tek VIP5Jr；輪轉式切片機，Thermo，HM325；全自動石蠟包埋機，Thermo，EC350-1；Micro-CT，BRUKER MICROCT N. V，型號Skyscan1176。

1.3模型制備小鼠實驗前適應性飼養1周。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/10g），待小鼠喪失意識，刮毛器刮除右側脛骨前方體毛。小鼠取仰臥位，絡合碘常規消毒，消毒面積近端達腹股溝，遠端至足趾。無菌孔巾覆蓋小鼠，僅暴露右后肢。沿右側脛骨縱軸做一切口，暴露皮下組織和脛骨前緣。取27號注射器針頭1枚，沿脛骨骨髓腔縱軸插入至約1/2脛骨總長度時，拔除針頭。肉眼尋找脛骨前外側向前凸起最高點，取11號刀片，在此凸起最高點后約3mm垂直緩慢戳入脛骨，刀片基本與操作臺同一水平時，用小錘子垂直敲擊刀片基部，直至聽到“啪”聲，刀片尖戳入泡沫板；移除刀片，輕輕側方移位活動以確認骨折構建成功。取一枚25號注射器針頭，復位固定；用鋼絲鉗橫行剪斷針頭；絡合碘消毒皮膚，間斷縫合皮膚［3］。

1.4分組與給藥依據術后正側位X線片，只選擇發生脛骨中部單發橫形骨折的小鼠進行分組［4］，剔除不符合者后，60只小鼠隨機分為兩組：模型組30只，治療組30只，每組再隨機均分成4、7、10、14、21 d 5個時間段［5］。術后肌肉注射青霉素4萬U和慶大霉素1萬U，以預防感染，連續2 d。治療組在術后24 h開始灌胃給藥續斷水提液（質量濃度4.5 g/mL，0.4 mL），模型組則給予0.4mL生理鹽水灌胃，每日1次。

1.5樣本采集與檢測造模后4、7、10、14、21 d予0.3%戊巴比妥鈉0.3mL/10 g注射處死小鼠，取整個脛骨。10%中性甲醛固定標本后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）中性脫鈣液中脫鈣4周后，脫水機脫水處理，石蠟包埋，連續切取厚度為3μm組織切片，60℃烤片過夜，待制備組織切片。1）X線：取兩組5個時間段的骨折樣本，4%多聚甲醛固定72 h后，Skyscan1176進行X線掃描，得到骨折側位二維圖像。此外，通過3名不同的實驗員（采用盲法）對X線骨折線模糊程度進行評價。2）Micro-CT：取各實驗組5個時間段的骨折樣本，運用Skyscan1176進行掃描分析。電壓42 kV、電流555μA，濾光片Al 0.2 mm，分辨率8.73μm，掃描角度360°，獲取連續的平面CT圖像。選出橫行骨折端上下各200張圖片作為感興趣區域（ROI），運用機載軟件進行骨折端骨痂三維圖像重建與分析。主要檢測參數如下：骨體積（BV）、相對骨體積或骨體積分數BV/TV、骨痂表面積（TS）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）；結構模型指數（SMI）［5］。3）HE染色：將切好的載玻片，60℃烤片2 h后進行HE染色，步驟如下：二甲苯脫蠟3次，每次5 min，之后酒精梯度脫水，脫蠟脫水完成后，純水洗2次，每次3min，蘇木精染液染色1min，純水漂洗3次，每次3 min，PBS溶液浸泡1 min，純水漂洗3次，每次3min，直至充分藍化，伊紅溶液染色1min，隨后依次置于95%酒精3次、100%酒精2次、二甲苯3次，每次1min，中性樹脂封片［6］。

1.6統計學處理應用SPSS.19統計軟件。計量資料以（表示，采用t檢驗，組間不同時間點采用重復測量數據的方差分析。計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗，等級資料采用非參數秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1兩組骨折線二維影像分析見圖1，表1。通過X線獲得小鼠脛骨二維圖片，比較兩組間骨折線模糊程度［3］，發現兩組6只小鼠術后第4天、7天骨折線依舊清晰，未見任何骨性連接影像。術后第10天，兩組多數小鼠骨折線依然清晰可見，但在骨痂周圍可見少許骨性連接影像。術后第14天兩組小鼠骨折線多數已模糊，可見較多骨性連接影像在骨痂周圍。術后第21天治療組非常模糊比例達83.33%，而模型組仍有50%的小鼠處于模糊。

圖1　脛骨骨折線X線平面圖

表1　小鼠骨折線模糊程度觀察（n）

圖2　脛骨骨折端ROI區域骨痂3D圖

2.2續斷提取液對骨折端骨痂形成的影響見圖2。骨折端骨痂三維圖像重建，從圖中可以發現術后4 d，骨折端骨痂都較稀少；術后7 d骨痂的總量明顯增多，多數分布在骨折端骨膜附近；而在術后第10天治療組骨痂骨量較模型組多，且骨痂較多已經爬過骨折線；在術后14 d骨痂總量都達到峰值，治療組中骨痂網狀骨減少，可能已轉化為板狀骨，而模型組中仍然存在較多的網狀骨痂；在術后21 d模型和治療組骨痂均被吸收，與模型組不同，治療組中骨痂多數已轉化為致密的板狀。

2.3兩組Micro-CT檢測參數比較見表2。通過Micro-CT分析軟件進行骨痂微觀結構分析，得到相關參數。從表中可見在骨折術后14 d、21 d，治療組BV，BV/TV比值高于模型組，組間差異具有統計學意義（均P＜0.05）；而掃描區域組織TS在治療組和模型組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；此外，Tb.Pf與SMI兩組指標同樣在骨折術后14 d、21 d兩組間比較，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。

表2　兩組Micro-CT檢測參數比較（

表2　兩組Micro-CT檢測參數比較（

與模型組比較，△P＜0.05。

BV（mm3）0.12±0.03 0.63±0.05 1.53±0.13 14 d 2.78±0.17△21 d 1.60±0.12△模型組4 d 0.10±0.00（n=6）7 d 0.57±0.03 10 d 1.42±0.07 14 d 1.75±0.13 21 d 1.36±0.03組別　時間治療組4 d（n=6）7 d 10 d BV/TV TS（mm2）0.05±0.01 85.77±4.45 0.18±0.03 76.79±1.19 0.29±0.01 71.81±1.12 Tb.Pf（mm-1）SMI 46.42±1.74 2.53±0.08 21.02±3.39 2.18±0.13 13.39±1.06 1.81±0.08 0.42±0.01△70.11±1.39 0.31±0.02△69.72±0.47 7.80±1.06△1.50±0.06△0.04±0.00 87.22±3.27 48.85±2.41 2.59±0.05 0.17±0.01 75.82±0.87 23.02±6.73 2.25±0.17 0.27±0.01 71.58±1.06 14.82±1.08 1.84±0.11 0.28±0.02 69.78±0.45 13.01±1.21 1.84±0.05 0.25±0.02 70.49±0.35 11.51±1.55 1.74±0.06 9.82±1.82△1.63±0.05△

2.4兩組HE染色比較見圖3。骨折術后7、10、14和21 d樣本HE染色結果，考慮到骨折術后4 d組織多為血腫，在骨痂形態學上本研究在術后4 d并未進行比較。由圖3可見，術后7 d和10 d時，骨痂多為軟組織，14 d和21 d則逐漸向骨性轉化。在術后14 d和21 d兩個時間點，治療組骨痂骨量明顯多于模型組，而且治療組骨痂的形狀也更為規則，與皮質骨貼合更為緊密。

圖3　兩組術后7、10、14、21 d HE染色比較（50倍）

3　討　論

骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復反應，以恢復骨的正常結構與功能，骨折愈合過程是一個復雜的組織學、生物學、內分泌學及生物力學的動態過程［7］。治療中除采用手術、手法復位、夾板固定、練功活動等方法外，配合藥物治療也至關重要，而中醫藥治療骨折主要遵循骨折3期辨證施治原則。早期，骨折移位，軟組織損傷，組織充血水腫，腫脹明顯，治療主要以活血化瘀、行氣止痛藥物為主；中期，局部血腫吸收，水腫緩解、骨痂開始形成，而局部腫脹、疼痛仍然未盡，治療以接骨續筋類藥物為主；后期，骨折已臨床愈合，但氣血耗損，筋骨松軟，本研究治療以補益肝腎、強筋壯骨為主［8-9］。

續斷因其續筋接骨功效而得名［10］。本品性味苦、甘、辛，微溫，歸肝腎經，具有補肝腎，強筋骨，行血脈，療傷續折功效，為補肝腎療骨傷之要藥，廣泛運用在骨傷科疾病治療中，而續斷具體的作用機理也被所更多關注。程志安等［10］在體外實驗中，發現續斷能有效促進大鼠成骨細胞增殖、分化，抑制凋亡，這也被武密山等［11］證實，此外他們還發現續斷具有促進骨髓間充質干細胞增殖與向成骨細胞分化的作用。段衛華等［12］認為續斷能糾正局部腫脹，促進血腫的吸收、機化，加速膠原合成，改善膠原結構和排列來加速骨折愈合。而相關臨床試驗也發現，續斷可縮短骨折愈合時間，對老年骨折及骨折遲緩愈合有效果明顯［13］，其機理是續斷能促進骨折部位骨基質鈣沉積，提高骨痂質量，促進相關生長因子的分泌，加快骨折愈合這一復雜的生物學過程［14］。

Micro-CT技術是一種能全面、立體、精確、無創測量骨微結構手段，可精確計量標本整體骨量參數，準確描述結構的3D分布和形態特征，可補充X線、病理切片等二維觀測方法的不足［15］。Micro-CT檢測中，BV、BV/TV是觀察骨性骨痂的指標，是評價骨折愈合重要依據［16-17］。本研究結果表明治療組和模型組BV、BV/ TV值隨著時間逐漸升高，在術后14 d時達到高峰，而術后21 d均不同程度的降低，這可能與在骨折愈合后期骨痂的吸收有關［18］。骨折術后14、21 d治療組BV、BV/TV比值高于模型組（P＜0.05），提示續斷水提液可在骨折愈合中后節點增加骨性骨痂的生成，促進骨折愈合，這可能與補腎中藥促進成骨分化相關基因的上調作用發生在骨折愈合中后節點有關［19］，這也與組織形態學染色所現一致。Tb.Pf為骨小梁模式因子提示的是骨痂內骨小梁凸凹面的程度，其值變小表示骨小梁由桿狀向板狀變化，力學特性增強［20］。兩組在骨折術后Tb.Pf值逐漸變小，而在術后14 d、21 d治療組Tb.Pf值顯著低于模型組，說明續斷水提液在小鼠骨折愈合中后期可對骨痂再塑形，恢復骨的力學特性。SMI為骨痂的結構模型指數，反映骨痂內骨小梁板狀、桿狀的程度，趨近于0時骨小梁多為板狀，反之趨近3時骨小梁轉向桿狀，而在骨量減少相關疾病中SMI值常接近3［21］。在本實驗中，術后第14、21天治療組SMI均顯著低于模型組，說明續斷水提液在骨折愈合中后節點可使新生骨痂中力學強度較差的網狀、桿狀骨小梁向板狀轉化，而Tb.Pf、SMI值所提示的新生骨痂生物力學特性上的恢復，在HE染色中也有所體現，在術后14 d和21 d治療組骨痂的外形、方向都趨于恢復。

綜上所述，續斷作為代表性的續筋接骨藥，續斷水提液可以增加骨性骨痂的生成，同時又可對新生骨痂再塑形，加快恢復新生骨的生物力學特性，而且這些作用主要集中在骨折愈合的中后期。

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Experimental Study on Promoting Effect of Radix Dipsaci Extract on Tibial Fracture Healing in M ice under M icro-CT

WU Chunming，YUAN Huimin，YANG Di，et al.Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1682-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.011

2016-06-16）

·研究報告·

浙江省中醫藥科技計劃一般項目（2014ZB008）

（電子郵箱：Dean_yd@hotmail.com）