熱毒寧調節MCMV感染的肺炎模型小鼠肺組織內IFN-γ和IL-4水平的研究*

張文輝 左麗娜 孫　思 顧　翔 陳玉玲

（徐州醫學院附屬醫院，江蘇　徐州221002）

·實驗報告·

熱毒寧調節MCMV感染的肺炎模型小鼠肺組織內IFN-γ和IL-4水平的研究*

張文輝 左麗娜 孫思 顧翔 陳玉玲

（徐州醫學院附屬醫院，江蘇徐州221002）

目的觀察熱毒寧對鼠巨細胞病毒（MCMV）感染小鼠肺組織干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）細胞因子水平的影響及其抗MCMV作用機制。方法40只BALB/c鼠隨機分5組，每組8只，A為空白對照組，B為免疫低下對照組，C為MCMV肺炎模型組，D為熱毒寧治療組，E為更昔洛韋治療組。HE染色觀察小鼠肺組織的病理改變，熒光定量PCR檢測肺組織MCMV DNA的變化，酶聯免疫試驗（ELISA）法檢測肺組織中IFN-γ和IL-4的變化。結果1）與A組相比，C組肺組織病理染色顯示肺泡壁內有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增寬，部分肺泡腔內有蛋白滲出；MCMV DNA含量升高，肺組織中炎癥因子IFN-γ和IL-4明顯增多（P＜0.05）；2）與C組相比，給予藥物干預后，D、E組肺組織病理改變較前減輕，MCMV DNA含量降低，炎性因子IFN-γ和IL-4明顯下降（P＜0.05）；而D、E兩組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。結論熱毒寧干預后，肺組織的病理改變較前減輕，抑制CMV DNA的復制，IFN-γ和IL-4明顯下降；此效應可能是通過抑制CMV的復制周期并干預下游細胞因子從而發揮抗病毒作用。

熱毒寧更昔洛韋巨細胞病毒IFN-γIL-4

【Abstract】Objective：To investigate the effect and its anti-MCMV mechanism of Reduning Decoction on the expression of IFN-γand IL-4 of lung tissue in pneumonia model mice with MCMV infection.M ethods：40 BALB/cmice were randomly divided into five groups，8 in each：the normal control group（A），immunosuppressive control group（B），MCMV infection group（C），Reduning decoction group（D），and ganciclovir group（E）.The pathological changes of lung tissue inmice were observed by HE staining.Real time PCR was used to analyze expression of MCMV DNA；the expression of IFN-γand IL-4 was detected by ELISA.Results：Compared with the normal control group，the pathological changes of the lung tissue of themice in themodel group showed alveolar interstitial edema，alveolar wall wider and a large number of inflammatory cells；the number of MCMV DNA increased；the expression of IFN-γand IL-4 also increased significantly（P＜0.05）.Compared with themice in the model group，the pathological changes of the lung tissue of drug groups showed the inflammatory cells decreased；the number of MCMV DNA decreased，and the expression of IFN-γand IL-4 also decreased significantly（P＜0.05）.At the same time，the expression of IFN-γand IL-4 was no statistically significant between group D and E（P＞0.05）.Conclusion：After Reduning Decoction′s intervention，pathological changes of lung tissue decreased；the replication of CMV DNA was inhibited，and FN-γand IL-4 also decreased significantly.This effectmay be achieved by inhibiting the replication cycle of CMV and intervening downstream cytokines to exert antiviral effects.

【Key words】Reduning Decoction；Ganciclovir；Cytomegalovirus；IFN-γ；IL-4

巨細胞病毒（CMV）屬β-皰疹病毒亞科，是一組可以在宿主細胞中建立終身潛伏感染的特異性的皰疹病毒。CMV易感染免疫缺陷患者的器官、組織，同時它也是導致移植患者移植物喪失的主要原因［1-2］。目前已有研究證實，不論是在巨細胞病毒感染的潛伏或活化期，肺部都是一個最主要的感染器官。由于目前可用的抗病毒藥物有限以及長期低劑量的使用，以至于目前還

沒有有效的藥物以阻止CMV感染的炎癥反應。熱毒寧是新型中藥制劑，目前已成為國內治療病毒性疾病的一線用藥。國內大量的臨床研究已證實，熱毒寧對病毒性肺炎有一定的治療作用［3-4］，但它對CMV肺炎的作用以及對干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）細胞因子的影響尚不明確。通過檢測熱毒寧對MCMV感染模型小鼠肺組織中IFN-γ和IL-4細胞因子表達強度的影響，從整體水平上探討熱毒寧對MCMV感染小鼠肺組織IFN-γ和IL-4細胞因子水平的影響及其抗MCMV作用機制?，F報告如下。

1　材料及方法

1.1實驗動物選擇40只SPF級BALB/c雄性小鼠為研究對象，年齡均為8周齡（由徐州醫學院試驗動物中心提供），體質量23～27 g，平均（25.23±1.84）g，所有動物均在實驗室內行標準化飼養。

1.2藥物與試劑MCMV株由山東省醫學科學院微生物研究所提供。DNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司，IFN-γ、IL-4的ELASA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，PCR引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3分組與給藥BALB/c鼠隨機分5組，每組8只，A為空白對照組，B為免疫低下對照組，C為MCMV肺炎模型組，D為熱毒寧治療組，E為更昔洛韋治療組。A組腹腔注射成纖維細胞0.8mL/只，C組腹腔注射MCMV懸液0.8 mL/只；D組腹腔注射熱毒寧7.2 mL/kg，E組腹腔注射更昔洛韋60 mg/kg（每日1次，均連續給藥7 d），A組、B組、C組分別予以同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。上述劑量均按人與動物用藥量折算系數表計算用藥量。

1.4標本采集與檢測1）肺組織病理學。留取肺組織，甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織病理學改變（×400）。2）實時熒光定量PCR檢測MCMV DNA。將肺組織勻漿，離心后留取沉淀，按照DNA試劑盒說明分別提取肺組織中的MCMV-DNA。上游引物：5′-TCAGCCATCAACTCTGC TACCAAC-3′，下游引物：5′-ATCTGAAACAGCCGTA TATCATCTTG-3′。反應體系為10μL，DNA模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH2O 7μL，反應條件為95℃15 s，95℃5 s，58℃30 s，72℃10 s，40個循環。行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察結果、拍照。3）ELASA法檢測IFN-γ及IL-4的表達。將肺組織勻漿離心，留取上清液，嚴格按照ELISA說明行IFN-γ、IL-4的檢測。

1.5統計學處理應用SPSS16.0統計軟件分析。所有計量資料均以（表示，用單因素方差分析檢驗其差異性，組間兩兩比較用SNK檢驗完成。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組小鼠行為學異常表現情況比較A組和B組小鼠在實驗期間未表現出行為異常，C、D、E 3組的小鼠在MCMV 3 d后表現出嗜睡、活動減少、毛發脫落等異常。給藥后，D、E組小鼠用藥7 d時行為異常表現有所減輕，與C組相比明顯改善。

2.2光鏡下的病理學改變見圖1。A、B組未表現出明顯的病理改變，C組小鼠肺泡壁和支氣管周圍肺間質內有大量的炎性細胞存在，主要表現為肺泡壁增寬，肺泡腔內有大量蛋白滲出，肺間質內大量單核細胞浸潤表達。D組小鼠經熱毒寧干預后，肺組織病理改變較C組減輕；且E組減輕較D組更明顯。

圖1　各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，400倍）

2.3各組小鼠ELISA檢測IFN-γ和IL-4水平比較見表1。與A組比較，C組IFN-γ和IL-4明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；B組無明顯變化（P＞0.05）；D、E組IFN-γ和IL-4明顯少于C組（P＜0.05），且E組下降較D組更明顯（P＜0.05）。

表1　各組肺組織IFN-γ和MCP-1表達的比較（pg/mL，

表1　各組肺組織IFN-γ和MCP-1表達的比較（pg/mL，

與A組比較，△P＜0.05；與C組比較，*P＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05。下同。

組別n IFN-γIL-4 A組8 21.37±4.49 28.57±3.86 B組8 23.14±3.32 29.75±5.75 C組8 275.57±17.45△11.86±3.95△D組8 104.64±23.47*20.65±4.36*E組8 98.72±19.57*▲21.63±4.58*▲

2.4各組小鼠熒光定量PCR檢測MCMV-DNA表達比較見表2。與B組比較，C、D、E組的MCMV-DNA明顯升高（P＜0.05）；經藥物干預后MCMV-DNA較前下降（P＜0.05）；提示通過熱毒寧干預后，MCMV的濃度顯著降低。

表2　各組肺組織CMV-DNA的表達（Ig/mL，

表2　各組肺組織CMV-DNA的表達（Ig/mL，

組別n CMV-DNA A組8 1 B組8 1 C組8 4.52±1.13#D組8 2.37±0.44#*E組8 1.72±0.11#*

3　討　論

CMV是一種普遍存在的機會性致病菌，是目前已知的人類最大的病毒之一。雖然免疫功能正常的個體感染CMV后無明顯臨床癥狀出現，但它可在體內建立終身潛伏感染［5］。而在免疫缺陷患者中，如移植接受者、HIV患者感染CMV后可導致嚴重的后果［6］。理解CMV是如何引起并損害機體免疫反應的，對有效治療CMV具有重要作用。

研究顯示［7-8］，機體受到MCV感染后發生免疫紊亂的機制十分復雜，目前主要認為與細胞因子作用和細胞因子的表達失衡有著重要關系。細胞因子作為機體內免疫細胞分泌的對細胞功能具有調節作用的小分子多肽類物質，是調控細胞間相互作用、調節細胞生長和分化的主要功能性物質，細胞因子水平和功能的失衡則決定了細胞功能特別是免疫功能的狀態［9-10］。機體中，Th作為主要的免疫細胞，其主要分化形式為Th1細胞和Th2細胞，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等因子，是介導細胞毒性和局部炎癥的關節因子，廣泛參與細胞的免疫反應。相對應Th1細胞而言，Th2細胞則主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等白介素因子，主要功能是刺激B細胞分泌大量的免疫蛋白，調控免疫功能的形式以參與體液免疫反應為主［11］。正常機體狀態中，Th1和Th2細胞功能處于動態平衡，這兩種細胞因子的表達水平一旦失衡，將會導致機體發生免疫功能紊亂及自身免疫性疾病等，保持這兩種細胞因子的平衡是保障機體體液免疫和細胞免疫功能正常的重要原因［12-13］。有臨床研究指出，CMV感染可導致機體Th1/Th2平衡失調，而Th1/Th2平衡狀況又在CMV感染和其致病機制中具有十分重要的意義［14］。機體遭受病毒感染后，細胞因子在病毒感染過程中，可同時發揮宿主介導的病毒復制過程的參與者和病毒破壞免疫系統的重要的因子，可通過雙重作用促進機體免疫功能的紊亂和自身免疫的失調。

研究顯示［15］，機體遭受CMV感染后，被活化的NK細胞可產生大量的IFN-γ，可同時發揮抑制病毒復制和抑制炎性反應的雙重作用，被認為是Th1亞群中抑炎作用較強的因子。IL-4作為Th2細胞亞群所分泌重要細胞因子，被認為對CMV感染的炎性反應有著重要促進作用，所以臨床上常選擇IFN-γ/IL-4來反映Th1和Th2的優勢應答狀態［16］。在本研究發現，小鼠感染MCMV后，肺組織內的IFN-γ水平明顯升高，而IL-4水平則顯著降低，提示Th1/Th2處于失衡狀態且Th1抵抗MCMV的能力占優勢地位，有利于機體通過免疫防御機制調節消除病原體。IL-4表達水水平的下降程度有限，無法發揮強大的拮抗IFN-γ分泌的作用，對IFN-γ介導的肺組織的改善作用比較有限，可認為機體免疫調節功能失衡是造成MCMV感染相關肺組織損傷加重的重要因素之一。

本研究中，應用熱毒寧及更昔洛韋干預后，IFN-γ/ IL-4的值均較模型小鼠明顯增大，其中IFN-γ的表達下調，IL-4水平升高，MCMV-DNA表達減少，上述指標在兩治療組的變化趨勢相同，與更昔洛韋相似。熱毒寧通過調節IFN-γ及IL-4的表達，糾正CMV感染所致的Th1/Th2的失衡，可能是通過誘導Th1分化，造成Th1優勢反應狀態，從而增強了特異性細胞免疫功能，使機體提前進入恢復期，縮短病程，更有利于機體清除病毒，減輕這些炎癥因子引起的肺部炎癥損傷，保護肺組織。此效應可能與熱毒寧發揮抗病毒作用有關。本實驗是以小鼠模型為基礎，熱毒寧在臨床上的具體治療作用仍需大量的臨床實驗來證實，同時MCMV肺炎的具體機制及信號轉導通路尚待進一步的研究來明確。

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The Effect of Reduning Decoction on the Expression of IFN-γand IL-4 of Lung Tissue in Pneumonia Model M ice w ith MCMV Infection

ZHANG Wenhui，ZUO Lina，SUN Si，et al.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu，Xuzhou 221002，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1730-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.027

2016-04-09）

徐州醫學院附屬醫院院內科研課題（XYFY2013018）