microRNA-140通過下調HDAC4抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力△

王顯艷　高峰　趙春明　孫玉榮　溫秋婷　于秀文　張曉杰

1齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006

2齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院麻醉科，黑龍江　齊齊哈爾　161006

microRNA-140通過下調HDAC4抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力△

王顯艷1#高峰2趙春明1孫玉榮1溫秋婷1于秀文1張曉杰1

1齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江齊齊哈爾161006

2齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院麻醉科，黑龍江齊齊哈爾161006

目的探討microRNA-140（miR-140）對胃癌細胞SGC-7901遷移及侵襲能力的影響及其調控機制。方法將miR-140 mimics（miR-140）、miR-140特異性抑制劑（Anti-miR-140）和針對HDAC4的siRNA（HDAC4 siRNA）分別通過脂質體轉染至細胞，應用實時熒光定量（qRT-PCR）檢測細胞中miR-140和HDAC4 mRNA表達情況，并采用蛋白質印跡法（WB）分析HDAC4蛋白水平。采用Transwell小室模型分析miR-140上調和下調以及HDAC4調低對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響。結果miR-140轉染可使HDAC4蛋白表達降低，HDAC4 mRNA水平則無明顯變化。miR-140上調與HDAC4調低均可顯著抑制SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力，而在轉染了Anti-miR-140的SGC-7901細胞中HDAC4蛋白表達增高，細胞遷移和侵襲能力增強。結論miR-140在轉錄后水平調控HDAC4表達。miR-140抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力，部分是通過下調HDAC4而實現。miR-140可能作為腫瘤轉移診斷及治療的新靶點。

胃癌；microRNA-140；HDAC4；腫瘤遷移；腫瘤侵襲

Oncol Prog，2016，14（3）

胃癌是常見惡性腫瘤，在所有癌癥死亡率中排名第二，嚴重危害人民的健康。抑制胃癌細胞發生侵襲轉移是胃癌治療整體水平提高的瓶頸。經過數十年不懈努力，眾多學者從不同角度、不同方面對胃癌侵襲轉移機制進行了大量的研究，取得了許多重大進展，但胃癌侵襲轉移的具體作用機制到目前為止仍不清楚。因此徹底改善胃癌患者預后要從預防和治療胃癌轉移入手［1-2］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內源性、單鏈非編碼的RNA分子［3］。通過與靶基因mRNA堿基的3′端非編碼區（3′-UTR）通過不完全或完全配對相結合，在轉錄后水平沉默靶基因從而參與細胞增殖、分化、代謝和凋亡等多種生物學過程。近年來越來越多的研究表明miRNA還可作為腫瘤癌基因或抑癌基因參與腫瘤的侵襲和轉移過程［4］。

miR-140是一種在軟骨增生和發育及骨關節炎發生過程中起重要作用的微小RNA［5-7］。但關于miR-140與腫瘤發生發展過程的關系研究很少。Iorio等［8］應用芯片技術篩選上皮源性卵巢癌與正常卵巢組織之間的miRNA表達差異，發現miR-140在卵巢癌中的表達水平顯著降低。另有研究應用實時熒光定量（qRT-PCR）發現miR-140在神經膠質瘤由Ⅱ級到Ⅳ級的進展過程中表達增高［9］。但這兩項研究均缺乏對miR-140在腫瘤發生發展中的作用機制研究。有研究形式miR-140在結腸癌中表達顯著降低：miR-140可通過下調TGF-B信號通路中Smad3抑制結腸癌細胞增殖和轉移能力［10］。Tuddenham等［11］在小鼠細胞中，應用熒光素報告系統得出的結果提示蛋白乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）可能是miR-140的靶基因，miR-140通過抑制HDAC4表達來促進軟骨細胞的發育。本研究以胃癌細胞SGC-7901為實驗對象，通過體外實驗，從上調和下調兩個角度探討miR-140對其遷移和侵襲能力的影響，并闡明可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

人胃癌細胞SGC-7901細胞系購自上海生命科學研究院細胞資源中心，于含10％小牛血清（FBS）的DMEM培養基（購自美國Gibco公司）中，在37℃、5％CO2培養箱中常規培養。轉染試劑脂質體Oligofectamine和Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、miR-140 mimics及其無關序列和miR-140 inhibitor及其無關序列均購自美國Invitrogen公司。HDAC4 siRNA購自上海吉凱基因化學有限公司。基質膠（Matrigel）為美國BD Bioscience公司產品。Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2實驗方法

1.2.1miR-140上調實驗分組①空白對照組（control）：僅加入Oligofectamine；②陰性對照組（negative control，NC）：加入miRNA mimics無關序列和Oligofectamine；③miR-140上調轉染組（miR-140）：加入miR-140 mimics和Oligofectamine；④HDAC4 siRNA轉染組（HDAC4 siRNA）：加入HDAC4 siRNA和Oligofectamine。轉染前36 h，將2×105細胞/孔接種在6孔板中，待細胞長至30％～50％匯合時，參照Oligofectamine的說明書，將終濃度為100 nM的miR-140 mimics及其無關序列和HDAC4 siRNA分別轉入細胞，轉染后4 h加入20％FBS。

1.2.2miR-140下調實驗分組①空白對照（control）：僅加入Lipofectamine 2000；②陰性對照（Anti-NC）：加入miRNA inhibitor無關序列和Lipofectamine 2000；③miR-140下調轉染組（Anti-miR-140）：加入miR-140 inhibitor和Lipofectamine 2000。細胞接種方法同miR-140上調轉染實驗，參照Lipofectamine 2000的說明書，將終濃度為100 nM的miR-140 inhibitor及其無關序列分別轉入細胞，轉染后6 h加入20％FBS。

1.2.3qRT-PCR檢測轉染細胞內miR-140水平轉染后24 h收集細胞，TRIzol試劑提取總RNA。以10 ng總RNA為模板，應用High Capacity cDNA synthesis kit反轉錄生成cDNA，以U6作為內參。qRT-PCR分析在美國Agilent公司ABl7000上進行。反應條件：95℃變性10 min；95℃15 s、60℃60 s，共40個循環；循環結束后72℃延伸10 min，每個樣本均做3個復管。qRT-PCR所用試劑盒和引物均購自美國Applied Biosystems公司。miR-140表達水平與其內參U6相比較后得到ΔCT，再與NC組相比，所得結果按2-ΔΔCT法計算，以相對表達量（relative quantity，RQ）表示。

考慮到不同國家(地區)的節假日以及各股票市場的停牌日期等不同而帶來交易日上的差異，我們參考Hamao等(1990)的做法，剔除不完整數據及非同步交易數據，這也是學者們常用的一種處理方法，我們最終得到3341組觀測值的收益率序列。

1.2.4qRT-PCR檢測轉染細胞內HDAC4 mRNA水平轉染后24 h收集細胞并提取總RNA。以1 μg總RNA為模板按一步法RT-PCR試劑盒說明（日本TaKaRa公司）進行逆轉錄，采用帶有ROX的Platinum SYBR Green PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）檢測HDAC4 mRNA的表達水平，以GAPDH作為內參。HDAC4和GAPDH的特異性引物均購自美國Invitrogen公司，HDAC4序列：上游5′-CCACAGUCUCUGUGUAAACCAC-3′，下游5′-GAUGGUAUCCAUUUUGGUGA-3′。qRT-PCR分析在美國Agilent公司ABl7000上進行。反應條件：50℃持續2 min，95℃變性2 min；95℃15 s、60℃30 s，共50個循環。每個樣本均做3個復管。計算方式同上。

1.2.5蛋白質印跡法（western blot，WB）檢測HDAC4蛋白表達細胞轉染后48 h應用RIPA buffe（r購自北京碧云天生物技術研究所）提取總蛋白。將50 mg總蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。膜經封閉液作用后，與鼠抗HDAC4（1∶1000稀釋，美國Santa Cruz公司）4℃孵育過夜。膜漂洗后加入羊抗鼠紅外熒光二抗（1∶8000稀釋，美國LI-COR公司）孵育40 min，利用紅外熒光二抗成像系統（美國LI-COR公司產品）成像，采用Gel-Pro Analyzer軟件分析目的蛋白表達水平。內參鼠抗GAPDH（1∶1000稀釋），購自北京碧云天生物技術研究所。

1.2.6Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力轉染后72 h提取總蛋白，應用WB檢測HDAC4蛋白表達，驗證轉染成功后，通過Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。將60μl Matrigel（用無血清的DMEM培養液按1∶4稀釋）鋪于小室濾膜（孔徑8μm）上，并輕輕晃動小室使膠均勻充分地分布在小室上室面，置37℃培養箱1 h凝膠。細胞饑餓24 h后重懸，調整濃度至1.5×106/ml，向上室內加入200μl的細胞懸液（細胞數3×105個），下室加入含10％FBS的DMEM完全培養液600μl，置于細胞培養箱中培養。24 h后取出小室，用棉簽輕輕擦去位于上室的細胞，甲醇固定30 min，1％結晶紫染色15 min后，用PBS洗膜數次，直至將小室上多余的結晶紫染色洗去。置于倒置光學顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野計數并拍照，陽性細胞被染成紫色。細胞遷移實驗與侵襲實驗相比，前者無需預先進行Matrigel包被，其余步驟同侵襲實驗。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用兩單獨樣本t檢驗，組間比較采用t檢驗及方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1miR-140上調組miR-140的表達水平

胃癌細胞SGC-7901轉染miR-140后24 h提取RNA，采用qRT-PCR方法檢測miR-140表達水平。結果發現轉染后的SGC-7901細胞中miR-140表達水平是NC組的1.89倍，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1　NC組和miR-140組的miR-140表達水平

胃癌SGC-7901細胞轉染miR-140后48 h提取蛋白質，以control組和NC組作為陰性對照，HDAC4 siRNA作為陽性對照，通過WB檢測HDAC4蛋白水平。結果顯示，與兩個陰性對照相比，miR-140表達上調可顯著抑制HDAC4蛋白表達［control組（0.51±0.02），NC組（0.59±0.06），miR-140上調轉染組（0.05±0.01），P＜0.05］，而與HDAC4 siRNA組（0.05±0.03）水平相當，見圖2A。同時利用qRT-PCR方法檢測了miR-140組中HDAC4 mRNA表達水平為（1.18±0.11），與NC組的（1.00±0.07）相比，差異無統計學意義（P＞0.05，圖2B）。

圖2　上調miR-140對HDAC4表達的影響

2.3miR-140下調對HDAC4蛋白表達的影響

miR-140 inhibitor轉染后72 h提取蛋白質，采用WB檢測miR-140下調對HDAC4蛋白表達的影響。結果顯示，與control組（0.19±0.02）和Anti-NC組（0.24±0.04）相比，Anti-miR-140組（0.45±0.08）的HDAC4蛋白表達顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3　miR-140下調對HDAC4蛋白表達的影響

2.4miR-140上調對胃癌細胞遷移及侵襲能力的影響（圖4）

采用Transwell小室模型檢測miR-140對SGC-7901細胞遷移能力的影響。結果顯示，48 h后miR-140組、HDAC4 siRNA組穿膜細胞數分別為（68.2± 2.4）和（73.5±5.3），低于control組的（297.1±4.9）及NC組的（266.1±5.7），差異有統計學意義（P＜0.05，圖4A）。采用Transwell小室侵襲實驗檢測miR-140上調對SGC-7901細胞侵襲能力的影響。結果顯示，miR-140組、HDAC4 siRNA組穿膜細胞數分別為（109.5±7.4）和（108.8±3.6），低于control組的（303.1±5.1）及NC組的（482.6±8.4），差異有統計學意義（P＜0.05，圖4B）。

2.5miR-140下調對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響（圖5）

Transwell小室模型法顯示，24 h后Anti-miR-140組穿膜細胞數為（339.2±7.7），高于control組（127.2±3.1）及Anti-NC組（103.1±2.9），差異有統計學意義（P＜0.05，圖5A）。Transwell小室侵襲實驗結果顯示，Anti-miR-140組穿膜細胞數為（291.2± 6.4），高于control組（102.7±4.4）及Anti-NC組（109.4±3.1），差異有統計學意義（P＜0.05，圖5B）。

圖4　miR-140上調對SGC-7901細胞遷移及侵襲能力的影響（結晶紫染色，×100）

圖5　miR-140下調對SGC-7901細胞遷移及侵襲能力的影響（結晶紫染色，×100）

3　討論

轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，近年來的研究表明miRNA可作為腫瘤抑制基因或癌基因而參與腫瘤的發生及轉移過程。有報道miR-15a、miR-16-1、miR-34a和miR-145等的缺失與慢性淋巴細胞性白血病、大腸癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤的發生有關［12］，包括本研究在內的幾個不同研究小組發現受抑癌基因p53調控的miR-192和miR-215的過表達，可導致腫瘤細胞的細胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細胞增殖［9］，miR-192和miR-215下調與大腸癌和多發性骨髓瘤等的發生有關［10-15］。miR-21、miR-17-92 cluster和miR-221、miR-222等的過表達可促進大腸癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等腫瘤的發生，miR-10b、miR-335、miR-373和miR-520c、miR-9及miR-21等的異常則與腫瘤轉移密切相關［12-16］。這些研究結果表明miRNA的異常表達與腫瘤侵襲轉移行為密切相關，miRNA可作為腫瘤轉移的標志物，并可為腫瘤轉移治療提供候選靶點。

Song等［17］研究證實在結腸癌細胞HCT116和骨肉瘤細胞U-2 OS中miR-140在蛋白水平負調控HDAC4，并發現瞬時轉染miR-140可導致HCT116 和U-2 OS細胞中細胞周期調控蛋白p53和p21過表達，從而引起細胞周期G1和G2期阻滯，結果顯著抑制HCT116和U-2 OS細胞的增殖。

本研究將miR-140瞬時轉染至人胃癌細胞SGC-7901中，通過Transwell小室實驗發現轉染后的SGC-7901細胞其遷移和侵襲能力顯著下降，而轉染了miR-140特異性抑制劑的SGC-7901細胞則表現出較強的遷移和侵襲能力，表明miR-140具有抑制胃癌細胞遷移和侵襲的作用。這與最近報道的miR-140可抑制肝癌細胞和非小細胞肺癌細胞增殖和轉移能力的結果相一致［18-19］。

HDAC作為一種位于真核細胞中的蛋白酶，其主要功能就是修飾染色體的結構和調節其他功能蛋白，對腫瘤細胞生長、分化和凋亡過程均有調節作用，也可對基因表達起到指導作用。因此，HDAC是一個很有前景的癌癥治療方法，HDAC抑制劑已經成為當前研究人員熱門研究對象。較為常用的HDAC抑制劑也用于臨床腫瘤治療，如果能對腫瘤中各種HDAC家族蛋白的表達情況做以研究，可以加強其抑制劑的研發和應用［20］。

本研究發現miR-140轉染可下調SGC-7901細胞中HDAC4蛋白的表達，但其mRNA水平則無顯著變化，表明miR-140是在轉錄后水平調控了HDAC4的表達，這與Tuddenham等［11］的報道相一致。本研究進一步地應用siRNA敲低HDAC4在SGC-7901細胞中的表達，與轉染了miR-140的 SGC-7901細胞相比，兩組細胞的遷移和侵襲能力都明顯下降；當應用miR-140特異性抑制劑敲低miR-140后，則HDAC4表達增高，細胞的遷移和侵襲能力也顯著增強。以上結果表明HDAC4確是miR-140的靶點，并且miR-140是在翻譯水平下調HDAC4。同時表明miR-140抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力部分是通過下調HDAC4實現的。綜上所述，本研究結果可為miR-140作為腫瘤轉移診斷及治療的靶點提供理論依據。

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MicroRNA-140 suppresses the migration and invasion potential of gastric cancer cell through downregulating HDAC4△

WANG Xian-yan1#GAO Feng2ZHAO Chun-ming1SUN Yu-rong1WEN Qiu-ting1YU Xiu-wen1ZHANG Xiao-jie1
1Department of Pathology，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China
2Department of Anesthesia，the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China

ObjectiveTo investigate the role of microRNA-140（miR-140）in the migration and invasion potential of gastric cancer（GC）cell and the underlying mechanism.MethodmiR-140 mimics（miR-140），miR-140 specific inhibitor （anti-miR-140）or siRNA against HDAC4（HDAC4 siRNA）were transfected into human GC cell line SGC-7901 respectively using liposome.qRT-PCR was used to measure the expression levels of miR-140 and HDAC4 mRNA.HDAC4 protein was analyzed by Western blot.The in-vitro cell migration and invasion potential was determined by Transwell chamber assays after up-regulating or down-regulating miR-140 or knocking down HDAC4.ResultThe protein expression of HDAC4 was suppressed by miR-140 transfection without altering the target mRNA transcription level.The up-regulation of miR-140，andknock-down of HDAC4 by siRNA both inhibited the migration and invasion potential of SGC-7901 cells，down-regulation of miR-140 by the transfection of anti-miR-140 decreased the expression of HDAC4 protein，and enhanced the migration and invasion potential of SGC-7901 cells.ConclusionmiR-140 directly targets HDAC4 in the transcriptional level.miR-140 suppresses the migration and invasion potential of GC cell，at least partly through the downregulation of HDAC4.The findings of this study suggest that miR-140 may have a unique potential as a novel biomarker candidate for diagnosis and treatmentin tumor metastasis.

gastric cancer；microRNA-140；HDAC4；tumor migration；tumor invasion

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.03.09

2015-12-10）

黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目（12531804）

（corresponding author），郵箱：wangxianyan1974@163.com