玉米基因組學及農藝性狀基因克隆研究進展

高志勇 袁庭攀 趙亞蘭 尹三霞

摘要：介紹了玉米（Zea mays L.）基因組學的研究發展歷程，概述了玉米基因組學的研究進展。重點論述了玉米基因組的結構特征，玉米功能基因組學的發展現狀，玉米重要農藝性狀的基因克隆，包括株高和株型相關基因的克隆，產量相關性狀基因的克隆以及品質性狀相關基因的克隆，并展望了玉米基因組學的發展前景。

關鍵詞：玉米（Zea mays L.）；基因組學；農藝性狀；基因克隆

中圖分類號：S513；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1094-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.002

Research Progress on Maize Genomics and Gene Cloning of Agronomic Traits

GAO Zhi-yong1，2，YUAN Ting-pan1，ZHAO Ya-lan1，YIN San-xia1

（1. School of Chemistry and Life Science，Weinan Normal University，Weinan 714099，Shaanxi， China；

2. Key Laboratory of River Wetland Ecology and Environment in Shaanxi Province，Weinan 714099，Shaanxi， China）

Abstract： The paper introduces the development process of maize genomics， and summarizes the research progress of maize genomics. It focuses on the structural characteristics of the maize genome， functional genomics， and gene cloning of important agronomic traits， including plant height and plant type， yield， and quality traits. The future work was prospected on the development of maize genomics in the end.

Key words： maize（Zea mays L.）； genomics； agronomic traits； gene cloning

大約在1萬年前，在美洲中部墨西哥馴化了當地的類蜀黍，形成了玉米（Zea mays L.），從此，玉米一直在種植和培育。在歷史的長河中，玉米基因組經過了多輪的復制。大約在7 000萬年前，發生了古多倍體祖先的全基因組復制；5 000萬～12 000萬年前，進行了額外全基因組復制等。通過這些事件，玉米和它的近親高粱（Sorghum bicolor）分離開來。玉米的基因組有10條染色體，在進化中經歷了動態變化，使得玉米基因組在結構上顯示出復雜性。在過去的大約300萬年中，發生了長末端重復反轉錄轉座子（LTR retrotransposons）的增殖，使得玉米基因組發生了大規模的急劇擴增，基因組的大小達到了2.3×109。目前，作為一種重要的單子葉模式植物，尤其是由于其功能基因組學的發展和進步，玉米用在了許多重要的基礎研究上，主要的研究領域有基因和染色體的物理連鎖、基因的遺傳和功能、發育和細胞生物學、生物信息學的交叉、端粒的特征、基因的轉座、核仁的起源、數量遺傳和育種以及表觀遺傳學研究等。

1 玉米基因組的結構特征

2005年美國國家科學基金會、能源部、農業部資助玉米全基因組的測序工作。來自于美國的亞利桑那大學和圣路易斯華盛頓大學等科研機構的150名科研人員承接了這項工作。研究小組選取了B73自交系為測序材料，工作人員經過了4年多的艱苦努力，終于完成了測序工作，研究成果發表在了2009年11月份的《科學》期刊上[1]。測序工作中，科研人員利用細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）（n=16 848）和來源于完整的遺傳和物理圖譜的Fosmid克隆（n=63），進行了全基因組的測序，并且運用了光學圖譜進行了強度比。其中通過大約4～6倍的鳥槍法（Shotgun）對單克隆進行了測序，對一些獨特的區域又做了人工與自動完善，獲得了首版的B73參考基因組（B73 RefGen_v1）。B73 RefGen_v1揭示了玉米基因組的大小達到了2.3×109，并預測了32 000多個基因，其中99.8%的基因定位在了染色體上。Messing等[2]早年通過對玉米的全基因組中的大量插入克隆片段末端的測序，測序了基因組中的6.2 kb的片段，共累積了大約1/8的全基因組序列，其中對大量的基因和轉座子進行了描述。總的累積的序列有307 Mb，其中重復序列占了58%，基因區域占了7.5%，預測了大約59 000個基因。

在玉米的基因組中，由于存在高密度重復序列和復雜的結構，并且還有活性高的Mutator 轉座子，所以要對基因組進行精確的預測，會存在很大的困難。這個基因組中有幾百個轉座子基因家族，總共占了接近85%，在基因組中非均勻地散布，它們的轉座，造成了大量的基因復制和捕獲，該基因組中有接近85%是由非均勻分散于整個基因組中的幾百個轉座子家族組成。這些轉座元件影響了數以千計的基因片段的捕獲和復制，改變了著絲點的組成、大小及位置。

在玉米的基因組中，轉座因子（Transposable element，TE）含量非常豐富，B73 RefGen_v1中顯示轉座子占了85%，其中有豐富的Ⅰ類RNA轉座子和活躍的Ⅱ類DNA 轉座子[3]。在玉米中，最先發現了轉座子，并且 Spm/En系統、PIF/Harbinger、Hat（Ac轉座子）、Mutator 超基因家族、MITE家族最初也都是在玉米中發現的。

在玉米中還存在著長末端重復反轉錄轉座子，并且也非常豐富。大約82%的轉座子已經得到了鑒定。在各類轉座子家族中，最為復雜的是Mutator 超家族，其元件的大小和序列有著極大的差異，其中包含有262個MULEs（Mutator-like elements that contain gene fragments），MULEs 含有226個核基因的片段。通過對40 000個Mutator 活性區域的非冗余轉座子插入位點進行擴增和測序，對應地繪制到了B73 RefGen_v1中，試驗結果顯示，在減數分裂中，Mutator 插入位點重組率最高，許多轉座子都插入在含豐富基因及重組活性高的染色體的末端。

在植物、動物和真菌中，存在著一類稱作Helitrons 的轉座子。Helitrons 在玉米中含量豐富，轉座活性高，轉座方式采用滾環模式。在玉米中，有8個Helitrons 家族，大約總共有20 000個拷貝，在獲取基因片段時，其表現異常活躍。在早先的動植物基因組研究中，顯示Helitrons大部分存在于基因富集區[4]。在B73 RefGen_v1中，長末端重復反轉錄轉座子的含量超過了全基因組的75%，它們在基因組中分散存在，它們的406個基因家族中，大部分的拷貝數小于10個。LTR retrotransposons 具有家族特異性，在染色體上分布也不均勻，像類Copia 因子（Copia-like elements）常常在基因豐富的常染色質區域大量存在，而類Gypsy 因子（Gypsy-like elements）卻大量存在于基因稀疏的異染色質區域，研究顯示長末端重復反轉錄轉座子含有的核基因片段大于180個。

隨著功能基因組學發展，產生了海量數據，也為研究提供了很好的生物信息學的平臺。玉米遺傳和基因組信息資源MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）提供了玉米相關功能基因的注釋和信息。美國谷類作物數據庫（http：//harvest.ucr.edu/）收集了大麥、短柄草屬、柑橘、咖啡、豇豆、大豆、水稻、小麥等作物的表達譜數據及相關的一些分子信息。而另一谷類作物數據庫Gramene Database（http：//www.gramene.org/）是一個以各種作物基因組信息為主的數據庫，同時具備高級的各基因組間的分析功能。英國UK CROPNET（http：//ukcrop.net/）是英國農作物生物信息學網絡數據庫，擁有很多其自己開發的數據庫和分析軟件，同時也收集了相關的一些文獻和美國該領域的一些信息。水稻（http：//ars-genome.cornell.edu/rice/）、小麥（http：//www.tigr.org/tdb/e2k1/tae1/）和Panzea（http：//panzea.org/database）等專一作物的數據庫，由美國TIGR institute維護的小麥基因組數據，提供小麥的基因組及基因注釋，同時，還提供其它谷類作物的同源基因數據，如玉米、大麥、高粱、水稻等主要農作物，為玉米功能基因組學研究提供大量不同數據和信息。

2 玉米功能基因組學研究進展

在玉米的研究史上，2009年的玉米自交系B73的測序完成可以說是一個大的飛躍，為玉米基因組學的研究提供了巨大的數據支撐。而后隨著分子生物學的迅猛發展，測序技術的進一步完善，B73 RefGen_v2隨之問世，使對玉米基因組的認識更加全面和精細，給玉米的分子生物學研究帶來了更大的便利。最近，在由冷泉港實驗室和深圳華大基因研究院等單位主導完成的玉米遺傳變異研究論文發表在Nature Genetics[5]上。Chia等[5]對105個野生和栽培玉米品種進行了測序和分析，成功構建了第二代玉米單體型圖譜（簡稱Maize HapMap 2），并對玉米的遺傳多樣性進行了全面分析。在研究中，他們建立了精密的群體遺傳學評分模型（Population-genetics scoring model），共鑒定了5 500多萬個遺傳分子標記，同時發現染色體結構變異（SV）在玉米野生種和栽培種的基因組中是普遍存在的，并且推測這些結構變異與很多重要的農藝性狀具有密切的關聯。

此外，在研究影響玉米基因組大小的主要因素時，研究人員發現染色體結（一種密集的DNA結構，Chromosomal knobs）的存在或缺失造成了“種內”玉米基因組大小出現很大的差異；而在“種間”進行比較時，他們發現玉米基因組大小的變化則主要與大量的轉座子有關。

考古學及遺傳學證實玉米大約馴化自1萬多年前，在馴化過程中，玉米經歷了一次特殊的表型轉變，這使其更加容易滿足人類的需求。通過對75個玉米株系（包括野生玉米、美洲各地的傳統品種和現代改良玉米品系）進行全基因組重測序，并對玉米馴化進行了全面的評估分析。研究發現玉米在經過人工馴化之后又產生了新的遺傳多樣性，并推測這很有可能是由于野生近緣物種的基因滲入所導致的。研究人員發現了數百個具有強烈選擇信號的基因，并推測這些基因可能在玉米的馴化過程中發揮著重要的作用[6]。此外，研究數據還表明在玉米的馴化過程中，千百年前古代農民應用的人工馴化方法似乎比現代育種學家所使用的方法發揮了更大的作用。

通過馴化，人類已經大大地改變了大芻草形態，成為今天可以辨認的玉米。這個系統作為研究復雜性狀適應、基因組進化以及其遺傳學和進化的模式。為了研究馴化如何重新形成玉米幼苗的轉錄組，分析38個不同的基因型玉米和24類蜀黍的基因型的18 242個基因表達譜，玉米與大芻草相比，超過600個基因具有顯著不同的表達水平。此外，超過1 100個基因表現出顯著共表達改變。這項研究不僅證明了隨著馴化玉米轉錄組發生改變，鑒定了幾個負責玉米進化的基因，而且明確了基因表達結合群體遺傳學分析可以獲得基因互補的信息[7]。

3 玉米重要農藝性狀基因的克隆

目前，許多模式植物已經測序，研究也更加深入，基因功能的研究方法也更加完善，玉米的功能基因組學研究也成為了分子生物學研究的熱點領域之一。定位克隆（Positional cloning）在早期的克隆基因研究中應用較多。相對于其他一些模式植物，玉米的基因組較大，重復序列多，重要基因的定位克隆令人望而卻步。隨著玉米全基因組序列的發表，DNA測序技術進步，以及玉米全基因組關聯分析和比較基因組學技術發展等，應用定位克隆技術也成功地克隆了玉米的重要關鍵基因和QTL。整合圖位克隆，比較基因組和關聯分析等多種方法來加速玉米株高主效QTL的克隆，即先使用高密度的遺傳圖譜迅速將玉米主效株高QTLs轉變為單個孟德爾因子，將其表型效應放大，然后再逐一地精細定位；接著利用比較基因組將不同作物之間各種不同的功能基因組平臺串聯起來進行基因候選；再使用定點的關聯分析、基因的跨物種轉化或者不同作物的株高突變體來驗證基因的功能。

3.1 株高和株型相關基因的克隆

莖稈是玉米株型的重要組成部分，是影響產量的重要因素。在玉米栽培和馴化過程中，其株型發生了兩次革命性的變化：即由多分蘗大芻草到獨稈和由高稈玉米農家種到半矮稈的玉米自交系的轉化。兩者變革使玉米的株型緊湊、密植不倒伏成為可能，為玉米的高產奠定了基礎。

目前，已知控制株高的基因在單子葉和雙子葉植物高度保守。玉米dwarf8（d8）突變體莖稈極端矮小，葉片縮短，花期變長。它編碼一個DELLA蛋白，是一個顯性對赤霉素不敏感的矮稈基因。dwarf3（d3）編碼一個細胞色素P450（CYP88A）蛋白，作用于赤霉素合成途徑[8]。玉米br2突變體莖稈節間縮短，二葉片、雄蕊的大小正常，br2基因控制生長素在莖稈中的極性運輸。玉米na1編碼一個與擬南芥DET2同源的蛋白，調節油菜素內酯生物合成，進而影響植株的高低。

在當前的研究中，玉米株高等重要農藝性狀QTL的克隆進展緩慢，主要原因表現在：大多數玉米株高等重要農藝性狀受多個遺傳效應低的QTL控制；表型自然變異的功能性位點多位于調控區，過于隱蔽，不易定位。在B73 X Mo17的群體中共定位了6個控制株高的QTL，解釋了73%的表型變異，加性效應在6.1 cM到9.1 cM之間。玉米開花相關基因vgt1（Vegetative to generative transition 1）功能性位點在該基因上游70 kb啟動子區[9]。控制玉米分蘗數的tb1開放讀碼框上游60～70 kb位置上插入了Hopscotch轉座子，使得玉米tb1基因表達上調，從而玉米多分蘗變成獨稈。

株型緊湊的玉米品種莖葉夾角小，上部葉片趨于直立。透光性好，宜于密植。最近，有人利用GWAS全基因組關聯分析，從玉米基因組中發現了160萬個遺傳位點。在此基礎上鑒定了與莖葉夾角性狀相關的基因。玉米品種之間莖葉夾角差異最大可達80。但是，發現單基因的最大效應僅能達到1.5。因此莖葉夾角的性狀是通過多個基因產生微小效應疊加的結果[10]。

3.2 產量相關性狀的基因克隆

玉米產量性狀也是復雜的數量性狀，受多基因和環境變化的影響。例如，用3×87-1的441個永久F2群體，定位了27個包括穗行數、百粒重等產量性狀的QTL。對71個歐洲玉米自交系掃描了9個多態性位點，證明其中6個與玉米開花期相關[11]。最近，在玉米第四染色體上克隆fea2基因，控制穗行數，并且存在一個產生基因表達量差異的功能性變異，但其位置仍然未知[12]。

落粒性也是一個重要的產量性狀。利用玉米祖先大芻草和玉米高代回交，含886個體的大群體迅速將兩個玉米主效落粒QTL精細定位[13]。該基因克隆策略是利用圖位克隆、關聯分析和比較基因組學手段結合馴化綜合征在禾本科植物類似分子遺傳學基礎的原理，首先同時克隆了高粱一個質量基因Sh1、兩個玉米落粒基因、一個水稻落粒QTL。高粱Sh1落粒基因序列存在三個功能變異，分別是調控Sh1表達的單倍型，Sh1失去第二和第三外顯子的大片段缺失，一個是調控Sh1第四外顯子被異常剪切的剪切位點變異。通過比較基因組學定位獲得四個同源區段，兩個玉米落粒QTL、一個水稻落粒QTL和一個谷子落粒QTL分別位于這4個區段內。因而，實現了QTL跨物種的基因克隆。

同時，玉米抗倒伏性狀是玉米產量相關性狀的關鍵因素，與莖稈組織細胞壁結構，纖維素組成和機械強度密切相關，作物倒伏或折斷是玉米高產穩產和機械化收獲的重要生物學基礎。作物抗倒伏性是由作物倒伏基因或者稱作脆稈基因所控制的。水稻中的脆稈基因有較為詳細的報導，但是在玉米中的研究甚少。已知玉米中有6個脆稈基因，分別是BK1、BK2、BK3、btn1、bk-x、bk2，而這些報道只是簡單遺傳和表型分析。利用基因同源性，推測bk2可能編碼類似糖基錨定蛋白，調控次生細胞壁纖維素合成，進而影響莖稈的機械強度[14]。因此，玉米的脆稈基因研究有待于功能基因組等相關技術的綜合運用。

3.3 品質性狀相關基因的克隆

玉米子粒的形成過程涉及一系列基因時空表達的改變和調節。利用4～6 d和7～23 d的胚乳構建cDNA文庫。分析其中Cotigs和Singletons，排除貯藏蛋白基因外，至少有5 000個基因發生了變化[15]。DNA芯片分析表明，在玉米幼穗4個發育階段，有2 794個基因表達發生變化[16]。針對玉米子粒動態形成過程，分別對授粉后不同灌漿階段粒重、子粒灌漿速率、淀粉積累相關酶活性和可溶性碳水化合物濃度進行QTL定位分析，表明粒重QTL定位分析結果受基礎材料、定位群體類型和大小、子粒灌漿時期、遺傳圖譜標記飽和度、定位方法和環境條件等多種因素的單獨和綜合影響。通過構建NILs精細定位和圖位克隆主要目標QTL，具有更為重要的理論意義。

子粒的氨基酸組成是衡量蛋白質品質的重要指標，尤其是賴氨酸和色氨酸的含量。Opaque-2基因突變體是高賴氨酸突變體，賴氨酸含量達4%左右[17]，這是由于Opaque-2子粒中zein蛋白含量大幅度下降，而非zein蛋白含量上升。但是，其子粒是軟質胚乳，產量相對較低，因而限制了其應用。后來由于Opaque-2修飾因子發現和應用，可使玉米子粒賴氨酸含量增加1倍。玉米Opaque-2基因控制的子粒，在普通玉米中賴氨酸含量為0.20%，色氨酸為0.06%，而高賴氨酸玉米中分別達到0.48%和0.13%，是普通玉米的兩倍多。并且高賴氨酸玉米子粒中的組氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天門冬氨酸等的含量略高于普通玉米。但是，在實際應用過程中如何將高賴氨酸的基因和軟質胚乳修飾的多個數量性狀基因導入骨干育種自交系當中仍然是巨大的挑戰。

4 展望

隨著玉米研究的更加深入，EMS誘變和Mutator 誘變突變體庫的建立，使得更多的玉米質量性狀的突變體被發現，定位克隆技術隨之發展更為迅速。目前，新的定位克隆技術在克隆基因上更為有效，更加完善了玉米基因組序列，玉米的功能基因組學研究將進入一個嶄新的發展時期。

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