水稻Kasalath改良品系基因轉化效率的初步研究

何行健　曾崇華　劉清波　陳芬　胡文彬　王作平　肖國櫻

摘要 以親本Kasalath和HD9802S為對照，Bar基因為篩選標記，初步評價了Kasalath改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉化效率。試驗共獲得15個獨立轉化事件，9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉化效率分別為0、0.65%、0、0.23%、0.40%和0.22%；初步結果表明改良品系9K18-7具有較高的基因轉化效率。

關鍵詞 秈稻；基因轉化效率；抗除草劑

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）05-0010-03

Abstract The transformation efficiencies of several improved lines from Kasalath（including 9K08-3，9K18-7，9K21-3，9K28-5，9K29-9，and 9K30-0）were preliminary evaluated by using parent Kasalath and HD9802S as check and herbicide resistant gene Bar as selective marker.Fifteen independent transformants were obtained in this study，and the transformation efficiencies of line 9K08-3，9K18-7，9K21-3，9K28-5，9K29-9，and 9K30-0 were 0，0.65%，0，0.23%，0.40% and 0.22%，respectively.It primary indicated that line 9K18-7 had higher transformation efficiency comparatively.

Key words Indica rice；transformation efficiency；herbicide resistance

水稻（Oryza sativa L.）是最重要的糧食作物之一，全世界近50%的人口以稻米為主食，90%的水稻產于亞洲。亞洲栽培稻一般分為秈稻和粳稻2個亞種，其中秈稻約占全球水稻產量的80%[1]。水稻在組織培養力和基因轉化效率方面對基因型依賴性強，不同基因型水稻的組織織培養力和遺傳轉化效率存在顯著差異。由于大多數秈稻不良的組織培養特性和極低的轉化效率，嚴重限制了轉基因技術在秈稻育種上的應用[2]。研究發現Kasalath是秈稻中易于組織培養和遺傳轉化的品種[3-4]，但是Kasalath農藝性狀較差，主要表現為高稈、有芒、株型松散、產量較低、生育期長等，嚴重制約了它在轉基因育種研究上的廣泛應用。水稻轉基因育種研究中亟需轉化效率高、農藝性狀好的秈稻品系。

早秈型溫敏核不育系HD9802S熟期早、農藝性狀優良[5]。本課題組從HD9802S/Kasalath后代中選出了組織培養力高、矮稈、生育期短、產量性狀較好的Kasalath改良品系[6]，但高培養力品系的基因轉化效率尚未檢測。本文報道了以農桿菌介導轉化法評價Kasalath改良品系基因轉化效率的初步結果。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

Kasalath改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0由本課題組培育[6]；秈稻品種HD9802S由湖北大學提供；Kasalath由本所提供、本課題組繁殖。

1.2 組織培養和基因轉化

組織培養方法參考文獻[6]，基因轉化方法參考文獻[7]。根瘤農桿菌菌株EHA105由本課題組購買、保存；質粒pCAMBIA3300由澳大利亞國際農業分子生物學應用中心惠贈，本課題組擴增、保存。植物組織培養力（%）=愈傷組織誘導率×綠苗分化率×100；基因轉化效率（%）=轉化事件數/試驗種子數×100。

1.3 轉基因植株檢測

PCR和Southern檢測方法參考文獻[8-9]。轉基因植株的除草劑抗性檢測：從T1代植株中選取健康葉片以1 g/L的草銨膦溶液涂抹葉上部標記部位，以受體材料為對照，7 d后觀察。

1.4 統計學分析

用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 轉化事件的鑒定

2.1.1 PCR鑒定。轉化后獲得的再生植株經煉苗移栽共成活18株，其中9株來源于Kasalath、2株來源于9K18-7、2株來源于9K28-5、3株來源于9K29-9、2株來源于9K30-0。對18株再生苗進行PCR檢測，結果表明，除了9K28-5和9K30-0中各有1株沒有檢測到Bar基因外，其余16株再生苗均能檢測到目的基因（圖1）。

2.1.2 Southern鑒定。再生植株基因組DNA經酶切后電泳、轉膜，以Bar基因片斷為探針進行雜交，除PCR鑒定為假陽性的2株外，其余16株均得到了雜交信號（圖2）。其中來源于Kasalath的有5株為單拷貝（圖2中泳道1、2、6、8和16）、4株為多拷貝（圖2中泳道3、4、5和7）；來源于9K18-7的有1株為單拷貝（圖2中泳道9）、1株為多拷貝（圖2中泳道10）；來源于9K28-5的1株為多拷貝（圖2中泳道11），1株無雜交信號（圖2中泳道17）；來源于9K29-9的有1株為單拷貝（圖2中泳道13）、2株為多拷貝且為同一轉化事件（圖2中泳道12、14）；來源于9K30-0的1株為單拷貝（圖2中泳道15），1株無雜交信號（圖2中泳道18）。結果表明本試驗共獲得15個獨立轉化事件。

2.1.3 草銨膦抗性鑒定。除草劑草銨膦涂抹葉片試驗發現，非轉基因植株葉片明顯變黃（CK），假陽性的再生植株表現與對照相似（11和12號），其余再生植株葉片傷害較弱或無明顯傷害（圖3）。結果表明分子檢測為陽性的再生植株對草銨膦有明顯的抗性。

2.2 基因轉化效率的評價

研究結果表明（表1）：親本Kasalath和HD9802S的組織培養力分別為28.17%和24.36%；改良品系9K18-7和9K28-5的組織培養力分別為38.96%和46.80%，高于2個親本；9K30-0和9K21-3分別為24.79%和25.24%，介于2個親本之間；9K08-3和9K29-9分別為4.10%和22.97%，低于2個親本。Kasalath和HD9802S的基因轉化效率分別為4.21%和0；改良品系9K08-3、9K18-7、9K21-3、9K28-5、9K29-9和9K30-0的基因轉化效率分別為0、0.65%、0、0.23%、0.40%和0.22%。改良品系9K18-7具有較高的基因轉化效率，達到0.65%，基因轉化效率介于高值親本Kasalath和低值親本HD9802S之間。

進一步分析了Kasalath改良品系中基因轉化效率與組織培養特性之間的相關性。結果表明（表2）：基因轉化效率與愈傷組織誘導率、綠苗分化率和成熟胚培養力之間的Pearson相關系數分別為0.692、0.375和0.547，相關性均不顯著；成熟胚培養力與愈傷組織誘導率和綠苗分化率之間的Pearson相關系數分別為0.871和0.966，相關性分別達到顯著和極顯著水平；綠苗分化率和愈傷組織誘導率之間的Pearson相關系數為0.754，相關性不顯著。

3 結論與討論

轉基因技術是一種快速、定向改良水稻的有效手段。自從1994年Hiei等[10]建立粳稻的農桿菌介導法高效轉化體系以來，粳稻的遺傳轉化工作迅速展開，取得了很多進展[11-16]。由于基因型不同，秈稻的基因轉化效率不高，研究進展較慢[17]，且主要集中于轉化體系的優化上。Rashid等[18]通過調整乙酰丁香酮用量、愈傷組織類型和共培養時間等因素，改變激素配比，建立了一種高效轉化中秈型水稻品種印度香米385的體系；Hiei等[19]研究了不同凝膠劑和共培養基對秈稻轉化效率的影響；葉松青等[20]主要針對秈稻轉化過程中涉及的愈傷組織的誘導、篩選、分化等進行了研究，還研究了脯氨酸、二甲基亞砜對分化的影響。但是，秈稻轉基因受體品種的改良方面研究較少。馬炳田[21]從優良三系雜交稻恢復系（SH527和SH163）、保持系（D62B、D297B和D702B）、兩系恢復系W2008、兩系不育系612S等材料中篩選，并建立了一套轉基因中間受體系統。秈稻轉基因優良受體品種的缺乏，在一定程度上制約了秈稻轉基因研究的發展。

本課題組從受體品種改良方面入手，利用培養力較好且易于轉化的秈稻品種Kasalath與農藝性狀較好、培養力高的不育系HD9802S雜交，結合分子標記方法，得到了291個優良品系，并篩選出培養力極顯著高于親本HD9802S和Kasalath的家系9K18和9K19，為水稻轉基因育種研究提供了較好的高培養力受體材料[6]。

水稻的組織培養和轉化是一個極為復雜的過程，在此過程中，組織培養特性被認為與轉化效率密切相關。李素娟等[22]通過16個秈稻品種和5個粳稻品種的遺傳轉化試驗，認為較好的組織培養力是獲得轉基因植株的前提。樊秀霞[23]通過對21個水稻品種的成熟胚組織培養特性以及轉基因效率的考察，發現這些水稻品種間組織培養特性和轉基因效率均存在顯著差異，認為水稻品種間組織培養特性和轉基因效率有關。Zhao等[2]認為一個水稻品種的遺傳轉化效率在很大程度上取決于它的組織培養力。但他們均沒有對組織培養力和轉化效率之間的關系進行系統研究，這可能與秈稻遺傳轉化的低成功率和難重復性有關。

本試驗對6個Kasalath改良品系進行遺傳轉化，獲得了6個獨立轉化體，相關分析表明Kasalath改良品系的基因轉化效率和組織培養特性之間的相關性并不顯著。Kasalath和HD9802S的組織培養力并沒有顯著差異[6]，但本研究中HD9802S的轉化效率為0，Kasalath的基因轉化效率4.21%。雖然劉風珍等[24]在花生的遺傳轉化研究上也獲得了類似結果，但由于本試驗獲得的轉化事件數少，還不具有普遍意義。因此，在后續篩選試驗中，一方面要加大試驗工作量，探索基因轉化效率和組織培養特性之間的內在關系，另一方面也要以基因轉化效率為最終衡量標準，篩選組織培養力和基因轉化效率都高的改良品系，為秈稻的轉基因育種研究提供理想的受體材料。

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