多孔介質含水率變化對洛克沙胂的希瓦氏菌生物轉化影響

柯正辰　辛梓　肖雅玲

摘要 作為一種廣泛使用的飼料添加劑，洛克沙胂經由畜禽糞便進入環境，產生潛在的砷污染。自然環境中，降雨變化具有時空分布不均勻性，導致土壤含水率時刻發生變化，從而對洛克沙胂的生物轉化產生影響。本研究選取自然界中常見的奧奈達湖希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）為模型微生物，利用多孔介質石英砂作為模擬土壤的介質，研究洛克沙胂在不同含水率情形下的生物轉化情況。研究結果表明，含水率的變化對于洛克沙胂的生物轉化過程影響明顯。在低含水率的條件下（12.50%），洛克沙胂難以被希瓦氏菌轉化；而當含水率提升后，洛克沙胂才能夠被S.oneidensis MR-1轉化。通過砷平衡分析可以看出3-氨基-4-羥基苯胂酸為洛克沙胂生物轉化的唯一產物，未檢測出無機形態砷。

關鍵詞 洛克沙胂；希瓦氏菌；含水率；多孔介質；生物轉化

中圖分類號 X53 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）05-0209-03

Abstract Roxarsone，one of wildly used animal additives，will enter in environment via the manure of poultry or livestocks，resulting in potential arsenic pollution risks.Due to the space-time heterogeneity of rainfall，soil moisture content fluctuated constantly，consequently influencing roxarsone biotransformation process.In this study，Shewanella oneidensis MR-1 and quartz sand were selected to represent as model bacteria and simulated medium，respectively，and the biotransformation process of roxarsoneat various moisture content were investigated.Results showed that moisture content remarkably affected roxarsone biotransformation.At low moisture content（12.50%），roxarsone was hardly transformed.While moisture content elevated，the majority of roxarsone could be reduced to HAPA as the sole product.Meanwile，no inorganic arsenic could be dectected.

Key words roxarsone；Shewanella oneidensis MR-1；moisture content；porous media；biotransformation

洛克沙胂（Roxarsone，3-硝基-4-羥基苯胂酸），因可促生長、抑制寄生蟲、使皮毛光滑以及提高喂食效率和產蛋率，近幾十年來作為畜禽飼料添加劑被廣泛應用[1-8]，我國肉雞飼養業每年排放到環境中的洛克沙胂及其代謝物約1 000 t，加上養豬業，排放量更高[9]。洛克沙胂本身是一種低毒性的有機胂制劑，會被畜禽以原形排到自然環境中，但暴露在自然環境或者堆肥過程中的洛克沙胂則有可能轉化成高毒性形態的砷化物，產生砷污染危害[10-13]。洛克沙胂在自然環境中主要轉化為三價砷化物、五價砷化物、一甲基胂酸（DMA）、二甲基胂酸（MMA）以及3-氨基-4-羥基苯胂酸（HAPA），其中三價砷化物毒性最高，對環境危害巨大[5，11-14]。

希瓦氏菌（S.oneidensis MR-1）是一種兼性厭氧菌，在土壤、海洋和其他水體中廣泛存在，最適生長溫度一般在25～40 ℃之間[15]，能在厭氧條件下利用多種電子受體，包括鐵（Ⅲ）、硝酸鹽、亞硝酸鹽和重金屬離子等，進行產能代謝和電子傳遞[16]。在自然土壤中，由于降雨的時空不均勻性，其含水率時刻發生變化，對生存其中的土壤微生物產生巨大影響。因此，研究含水率的變化對于深刻理解洛克沙胂的生物轉化過程至關重要。本文利用多孔介質石英砂作為模擬土壤的介質，選取了奧奈達湖希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）作為模型微生物，研究其在不同含水率情形下的轉化過程，明確洛克沙胂在土壤中的生物轉化機理。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種培養

S.oneidensis MR-1（MCCC 1A01706）細菌由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供，凍干管中的菌種經活化后使用。將菌種置于LB培養基中，在30 ℃下避光靜置培養至對數生長期，菌體在高速離心機（Eppendorf，5810R）中以90 000×g離心10 min后收集，用經滅菌的基礎試驗培養基重復洗滌3次、重懸。整個試驗中所用的基礎培養基為50 mmol/L碳酸氫鈉緩沖培養基[17]?；A培養基使用之前置于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻后加入30 mmol/L乳酸鹽，并調pH值為7.0。

1.2 多孔介質的制備

在整個試驗中，石英砂（270 μm）作為多孔介質，用去離子水洗滌3次，105 ℃烘干備用。石英砂使用之前用121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

1.3 試驗方法

本試驗在滅菌過的50 mL離心管中進行，每個離心管中分裝4 g石英砂。通過稱重法，測得這4 g石英砂的飽和含水率為40.25%。為了研究從干燥到飽和含水率之間不同情況，本試驗設置含水率梯度為12.50%、25.00%、35.00%、40.25%、100.00%。將重懸的細菌液與培養基以及洛克沙胂（純度>99%，Sigma-Aldrich）混合均勻，保證細菌濃度、乳酸鹽濃度和洛克沙胂濃度分別為8.0×106 cells/mL，50 mmol/L和1 mmol/L。分別向離心管中加入不同份量以上混合液，控制含水率水平。分別在0、20、35、85 h進行采樣分析。該試驗在厭氧條件下避光完成，控制溫度為（30.0±0.5）℃。所有試驗均設置3個平行樣，樣品使用同樣的方法進行測試分析。

1.4 樣品提取

取每個時間點的離心管，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L的H3PO4溶液和0.1 mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液以1∶9的體積比混合）20 mL，放入超聲震蕩器中超聲震蕩4 min，取上清液3 mL，用分光光度計測定其吸光度計算生物量。剩余樣品經55 ℃水浴加熱10 h，然后在10 000×g下離心5 min取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜，放入4 ℃冰箱待測[8，12]。

1.5 生物量的測定

本試驗的細菌生物量由紫外分光光度計（UV-2600，Unico Instrument Co.，Ltd.）以及吖啶橙熒光染色計數法確定[18]。吖啶橙熒光染色之后的菌液濾過0.2 μm的黑色聚碳酸酯濾膜（Whatman，25 mm diameter），將濾膜固定在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus Co.，Japan）下鏡檢計數，整個試驗過程在暗室中進行，盡量避光以防熒光淬滅[19]。并與菌液在600 nm下測得的吸光度呈對應關系，做成標準曲線。試驗中的樣品測得吸光度后可參照標準曲線得到細菌的生物量。

1.6 分析方法

洛克沙胂和HAPA的濃度由高效液相色譜儀（HPLC 1260，Agilent Technology）測定，使用的色譜柱為Elite Hyper-silODS2 column（4.6 mm× 150 mm，5 μm），用純凈水配置10 mmol/L磷酸二氫鉀溶液pH值調至7.2作為流動相，流速為1.0 mL/min，進樣量為10.0 μL，洛克沙胂和HAPA的檢測波長分別為450 nm和300 nm，柱溫設置為（30.0±0.5）℃[8]。

包括三價砷化物、無價砷化物在內的無機砷檢測由高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光聯用技術（HPLC-HG-AFS）得到，試驗方法參考Huang等[12]的方法。

乳酸鹽濃度的測定由高效液相色譜儀（HPLC 1260，Agilent Technology）測定，使用的色譜柱為CNW Sep H-M column（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為用純凈水和優級純硫酸配置的2.5 mmol/L硫酸溶液，流速為0.25 mL/min，進樣量為2.0 μL，檢測波長為210 nm，柱溫保持在為（55.0±0.5）℃[20]。

2 結果與分析

2.1 含水率變化對希瓦氏菌生物量的影響

從圖1中可以看出，整個試驗過程中，含水率水平在12.50%和25.00%的試驗組細菌數目幾乎沒有變化，維持在初始濃度水平，說明該含水率水平不足以提供希瓦氏菌生長繁殖所必須的水環境。而當試驗含水率提高到35.00%以上時，細菌數量則優明顯增長。在試驗進行到20 h時，含水率為35.00%的試驗組細菌數目達到1.23×107 cells/mL；飽和含水率40.25%以及100%含水率水平組中細菌數目濃度接近，達到1.29×107 cells/mL左右。

隨著試驗時間延長，不同含水率水平試驗組中細菌數目差距變大，含水率水平高的細菌生物量大，含水率水平低的細菌生物量小。在飽和含水率40.25%以及含水率100.00%的2組，由于后者能給試驗菌種提供更好的水環境，導致了細菌數目上的差距增大。

2.2 含水率變化對底物乳酸鹽的影響

乳酸鹽在試驗中為細菌生長繁殖提供碳源，同時提供希瓦氏菌還原洛克沙胂所需要的電子，從圖2中可以看出，試驗中乳酸鹽的變化情況。與細菌生物量變化規律類似，在含水率水平為12.50%和25.00%的試驗組中乳酸鹽幾乎沒有被利用，一直保持在30 mmol/L左右，這與2組試驗中細菌數量沒有增長相互印證。

在含水率較高的試驗組中，乳酸鹽被作為碳源以及電子供體消耗，其消耗量變化趨勢與細菌數目增長的量呈相對應的關系。試驗終止時，含水率35.00%的試驗組中，乳酸鹽的含量為8.95 mmol/L；含水率上升到40.25%時，乳酸鹽含量下降到7.39 mmol/L。當含水率增大到100.00%時，乳酸鹽含量最低，為1.60 mmol/L。乳酸鹽被消耗多的試驗組試驗終止時對應的細菌數目含量也是最多的。

2.3 含水率水平對洛克沙胂生物轉化的影響

含水率水平明顯會影響到多孔介質中希瓦氏菌轉化洛克沙胂，從圖3中可以看出，含水率在12.50%和25.00%時，洛克沙胂基本維持在初始添加的濃度（1.0±0.1）mmol/L，沒有被希瓦氏菌所轉化。當含水率逐步提高后，洛克沙胂轉化效率逐步提高。在試驗開始后的20 h，含水率水平35.00%、40.25%和100.00%試驗組的洛克沙胂濃度分別下降為0.63、0.52、0.54 mmol/L。相對而言，含水率水平為35%的試驗組中洛克沙胂轉化率較低，而飽和含水率40.25%以及100.00%含水率水平組中洛克沙胂轉化程度相近。這是由于在飽和含水率40.25%和100.00%含水率2組中細菌增長數目相近（圖1），而且有足夠的水環境供希瓦氏菌轉移電子。在試驗進行到35 h，含水率35.00%、40.25%和100.00%水平組的洛克沙胂含量進一步降低到0.19、0.13、0.06 mmol/L。結果表明，含水率水平能夠顯著影響洛克沙胂的轉化過程，并且其轉化率隨著含水率的增高而增高。洛克沙胂的生物轉化過程與因為在該時刻不同含水率水平下希瓦氏菌的細菌量是不一樣的（圖1），因此能有效轉移給洛克沙胂的電子量不一樣，從而洛克沙胂被還原的量有所差別。在試驗終止時，除了含水率水平在12.50%和25.00%的試驗組，洛克沙胂均已完全轉化。

2.4 不同含水率條件下HAPA的生成情況

在整個試驗過程中，HAPA濃度如圖4所示，樣品在高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光聯用技術（HPLC-HG-AFS）檢測中并沒有發現除了洛克沙胂和HAPA以外其他形態的砷存在。

從圖4中可以發現，含水率為12.50%和25.00%的試驗組中沒有檢測到HAPA的存在。隨著試驗進行，在第20 h，35.00%、40.25%、100.00%含水率水平的試驗組中HAPA濃度分別為0.37、0.48、0.46 mmol/L，含水率水平為35.00%的試驗組中HAPA濃度較低，而飽和含水率40.25%以及100.00%含水率水平組中HAPA濃度相近。在試驗進行到35 h，含水率35.00%、40.25%和100.00%水平組的HAPA濃度進一步增加到0.78、0.87、0.94 mmol/L，結果表明含水率越高，洛克沙胂還原率越高。在試驗終止時，除了含水率水平在12.50%和25.00%的試驗組，HAPA濃度均在（1.0±0.1）mmol/L。對比2.3中洛克沙胂的試驗數據，洛克沙胂和HAPA的濃度符合砷的平衡，即在試驗條件下，洛克沙胂完全轉化為HAPA。

3 結論

針對不同含水率情形下希瓦氏菌對洛克沙胂的生物轉化研究整個試驗中得到的數據分析研究，得出以下結論：①多孔介質中含水率能明顯影響希瓦氏菌轉化洛克沙胂，只有到達一定含水率水平，足夠提供希瓦氏菌生長繁殖以及轉移電子的水環境，洛克沙胂才能夠被希瓦氏菌所轉化，該臨界值可以通過試驗來確定。②在洛克沙胂能夠被希瓦氏菌所轉化的含水率條件下，含水率越高，洛克沙胂被轉化的效率越高。③在試驗條件下，洛克沙胂被轉化后的產物全為HAPA，沒有檢測到其他形態的砷化物。

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