AIDA—1基因的克隆與鑒定

袁錦雯 高珮芬 馬珺茹 王怡琳 續(xù)苪 趙李祥

摘要：為了克隆AIDA-1基因并對(duì)其定序，通過PCR方法從大腸桿菌E393中擴(kuò)增出AIDA-1基因，通過酶切的方法克隆到pMD19-T simple載體中，再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，并通過基因測(cè)序的方法測(cè)定了AIDA-1的序列。 結(jié)果表明：成功克隆并測(cè)定了AIDA-1的序列，為蛋白展示、疫苗開發(fā)提供了重要的材料。

關(guān)鍵詞：克隆； 測(cè)序； AIDA-1基因

中圖分類號(hào)：Q36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2016）08018401

1 引言

AIDA-1為革蘭氏陽性菌的IV型分泌系統(tǒng)，可在革蘭氏陰性菌表面形成桶裝結(jié)構(gòu)，展示其N-端攜帶的蛋白[1～3]。IV型分泌系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌表面展示外源蛋白的過程中，無需其他因子的輔助，因此是方便高效的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。該展示系統(tǒng)在疫苗的研制及表位篩選等方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。本研究擬通過PCR方法，獲取AIDA-1基因。

2 材料與方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上公布的AIDA-1的序列設(shè)計(jì)了上、下游引物。

2.2 PCR擴(kuò)增

取1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌E393，煮沸10 min，12000 rpm離心2 min，取上清作為PCR模板[4～6]。PCR反應(yīng)體系為50 μL其中包含：5 μL大腸桿菌模板，5 μL PCR反應(yīng)緩沖液，1 μL dNTP，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，滅菌超純水36 μL。將PCR反應(yīng)混合液混勻后，通過如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min、 57 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min 共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min， 4 ℃ 10 min。取20 μL的PCR產(chǎn)物，在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，條件為80 V 50 min。

2.3 PCR產(chǎn)物的回收及連接

按照凝膠回收試劑盒說明回收AIDA-1產(chǎn)物。分別取4 μL PCR產(chǎn)物、1 μL pMD19-T simple載體及5 μL連接緩沖液，輕輕混勻后置于4 ℃連接過夜。

2.4 轉(zhuǎn)化及序列測(cè)定

取10 μL連接產(chǎn)物，加入到100 μL新鮮的DH10B的感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕混勻，冰浴30 min；在42 ℃水浴鍋中熱休克90s；立即加入800 μL的LB培養(yǎng)基，并輕輕混勻，置于37 ℃搖床中培養(yǎng)50 min。取400 μL培養(yǎng)物涂布于含有IPTG、V-gal及氨芐青霉素的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上的白色菌落進(jìn)行測(cè)序分析。

3 結(jié)果與結(jié)論

通過PCR成功擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)DNA測(cè)序表明AIDA-1基因被成功克隆至T載體中。克隆的AIDA-1基因片段，可廣泛應(yīng)用于革蘭氏陰性菌表面展示。該表面展示系統(tǒng)可以在細(xì)菌表面展示外源蛋白，可與流式細(xì)胞術(shù)等高通量的檢測(cè)及分離方法結(jié)合，應(yīng)用于疫苗的制備、生物吸附劑的研制及抗原表位的篩選等領(lǐng)域。因此，本研究克隆的AIDA-1基因?yàn)槲覀兒笃诘难芯刻峁┝瞬牧匣A(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景和應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Stordeur P， Marlier D， Blanco J， et al. Examination of Escherichia coli from poultry for selected adhesin genes important in disease caused by mammalian pathogenic E. coli[J]. Vet. Microbiol， 2002， 84（3）：231～41.

[2]吳琛耘，吳建和，劉晶星.細(xì)菌的Ⅲ型和Ⅳ型分泌系統(tǒng)[J].國外醫(yī)學(xué)（微生物學(xué)分冊(cè)），2004，27（2）：19～21.

[3]原志偉，朱國強(qiáng).細(xì)菌I型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2007，18（1）：129～131.

[4]張少峰，劉國強(qiáng)，魏春雷，等。糞大腸桿菌檢測(cè)方法及研究進(jìn)展[J]. 海洋通報(bào)，2008，27（3）：102～106.

[5]羅 樨，王 強(qiáng)，赫 然，等。大腸桿菌質(zhì)粒DNA PCR模板的快速制備[J].生物技術(shù)，2002，11（2）：38.

[6]蘇應(yīng)斌，莫道君，戴天力.改進(jìn)的PCR模板制備及DNA回收方法[J].湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18（1）：24～25.