MicroRNA-219-5p靶向E-鈣黏蛋白調控上皮間質轉化抑制肝癌細胞侵襲轉移

朱理輝，羅勇，廖文秋，張琍，李國慶

（南華大學附屬第二醫院1.消化內科，2.重癥醫學科，湖南衡陽421001）

MicroRNA-219-5p靶向E-鈣黏蛋白調控上皮間質轉化抑制肝癌細胞侵襲轉移

朱理輝1，羅勇2，廖文秋1，張琍1，李國慶1

（南華大學附屬第二醫院1.消化內科，2.重癥醫學科，湖南衡陽421001）

目的研究MicroR NA-219-5p（miR-219-5p）靶向E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）調控上皮間質轉化（EMT）抑制肝癌細胞侵襲轉移的分子機制。方法首先通過生物信息學方法，尋找與E-Cadherin結合特異性最好、穩定性強的miR NAs。在30例肝癌組織和20例癌旁肝組織中，通過蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測E-Cadherin的表達水平；實時熒光定量PCR檢測（qR T-PCR）miR-219-5p表達，分析兩者之間的相關性。在高轉移和低轉移的肝癌細胞株中，qR T-PCR檢測miR-219-5p表達，Western blot檢測E-Cadherin、N-cadherin表達。采用Lipofectamine 2000將miR-219-5p模擬子（mimic）、抑制子（inhibitor）、陰性對照組（negative contral）轉染到肝癌HepG2細胞系，qR T-PCR檢測miR-219-5p表達，Western blot檢測E-Cadherin、N-cadherin的表達；Transwell方法檢測miR-219-5p表達改變對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響。結果生物信息學發現miR-219-5p與E-Cadherin結合最穩定，且特異性最好。肝癌組織中miR-219-5p低表達、E-Cadherin高表達，而癌旁組織中miR-219-5p高表達、E-Cadherin低表達。高轉移細胞株中miR-219-5p高表達、E-Cadherin低表達而N-cadherin高表達，在低轉移細胞株中miR-219-5p低表達、E-Cadherin高表達而N-cadherin低表達（P<0.05）。miR-219-5p水平表達增高，引起E-Cadherin表達下調，N-cadherin高表達；miR-219-5p表達下調，可引起E-Cadherin表達上調，N-cadherin低表達（P<0.05）；HepG2-miR-219-5p模擬子細胞株中侵襲細胞計數為（24±3）個/高倍鏡視野，明顯低于對照組細胞株（P<0.05）。結論miR NA-219-5p可通過靶向結合E-Cadherin，調控EMT信號通路，抑制肝癌細胞的侵襲轉移。

miR NA；肝癌；侵襲轉移；E-Cadherin；上皮間質轉化

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發于肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤，惡性程度高，容易發生血道轉移，早期診斷困難。因此，臨床上大多數肝癌患者就診時，已處于臨床中晚期，預后較差[1]。目前，臨床上治療肝癌總的療效仍不理想，大多數患者治療失敗的原因是由于腫瘤發生轉移[2-3]。目前針對肝癌轉移復發的分子機制的研究，對于探索肝癌的臨床治療新方法和提高療效，具有重要的臨床和現實意義。

上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）指上皮細胞轉變為具有間質細胞表型的生物學過程。在胚胎的發育、炎癥、組織的重建、癌癥轉移過程中具有重要作用[4-5]，其主要的特征有：如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-catenin、角蛋白等表達下調，而間質細胞表型的N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白等表達上調，并且誘導上皮-間質轉化的細胞因子和轉錄因子表達上調等[6-7]。腫瘤細胞發生EMT，導致上皮細胞失去極性，黏附能力下降，從而失去與基底膜的連接，獲得較高的遷移與侵襲能力，以及降解胞外基質等能力[8]。EMT與腫瘤侵襲轉移關系密切，但有關EMT的調控分子機制目前尚不清楚。研究發現，在HCC臨床研究和動物實驗中，發現EMT的發生與肝癌細胞的轉移以及化療藥物耐藥有關，在此過程中，許多microRNAs（miR）分子參與了EMT的調節[9]。本研究擬探討肝癌細胞中，miR調控E-Cadherin影響EMT與肝癌細胞侵襲轉移的分子機制。

1 資料與方法

1.1臨床標本及資料

30例原發性肝癌組織標本及20例癌旁正常肝組織標本均來自南華大學附屬第二醫院消化內科住院患者活檢或手術切除的新鮮標本。原發性肝癌患者，男性19例，女性11例；年齡32~75歲，中位平均（55.5±7.2）歲。20例癌旁正常肝組織來源于肝組織活檢。所有病例均經兩位高年資副主任以上職稱的病理醫生診斷，結果均證實準確無誤。置入-80℃冰箱冷凍保存備用。

1.2細胞株

肝癌細胞系HepG2、人肝癌細胞低轉移細胞系MHCC97-L、人肝癌細胞高轉移細胞系MHCC97-H均購自中南大學細胞中心。

1.3主要試劑

免疫組織化學SP法試劑盒為福州邁新生物公司產品，鼠抗人單克隆E-Cadherin、N-cadherin抗體、β-actin抗體、過氧化物酶標記的二抗、脂質體Lipofectamine 2000均購自美國Santa Cruz公司，qRT-PCR試劑為日本TaKaRa公司產品，Transwell侵襲試劑盒為美國Corning公司產品，Matrigel膠為美國B&D公司產品。

1.4生物信息學分析

E-Cadherin（CDH1）的靶miRNAs預測：通過miRwalk在線程序進行，利用10個常用的生物信息學軟件對miRNA-CDH1之間的結合進行預測和分析。預測與CDH1結合的最佳靶miRNA：通過mi-Randa在線程序進行熱力學穩定性評分以及序列保守性評分，對miRNAs-CDH1之間結合的特異性和穩定性進行排序。

1.5qRT-PCR

首先采用Trizol法提取總RNA。PCR擴增采用兩步法進行。程序設定如下：95℃、30 s進行1個循環；95℃、30s，60℃、30s，進行40個循環。miR-219-5p的qRT-PCR引物，正向引物：5'-CCGCCCCGGGC CGCGGCUCC-3'，反向引物：5'-GCCCCCAAACCUCG AGCGGG-3'，由廣州銳博生物科技有限公司技術合成。在實時熒光定量PCR儀上進行檢測，實驗重復3管，取平均值。反應體系如下：10μmol/L正向引物1μl；10μmol/L反向引物1μl；DNA模板2μl；ddH2O 8.5μl；2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μl；總反應體系為25μl。

1.6蛋白免疫印跡法（Western blot）

提取細胞的總蛋白，Bradford法測蛋白濃度；蛋白樣品置于100℃水浴中變性5 min；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）電泳，設定電壓為100 V，時間約1～2 h；采用聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜三明治轉移法，轉膜電壓為100 V，時間為1 h；麗春紅溶液染色3～5 min；5%脫脂奶粉封閉，1～2 h；雜交袋中，加入5%的封閉液和一抗（濃度為1︰1 500），4℃冰箱中過夜；再與二抗結合（濃度1︰1 000）；暗室中壓上X線片，曝光約30～90 s，定影顯影、洗片，最后通過掃描儀進行圖像掃描。

1.7Trasnwell實驗

采用Lipofectamine2000將miR-219-5p模擬子（mimic）、抑制子（inhibitor）、陰性對照組（negative contral）轉染到肝癌HepG2細胞系，獲得3個重組細胞株：HepG2-miR-219-5p mimic、HepG2-miR-NC、HepG2-miR-219-5p-inhibitor。具體步驟如下：培養細胞密度到3×105/孔，6孔板接種。細胞融合度達80%時，進行脂質體轉染。Transwell侵襲小室實驗：①侵襲小室的預處理：首先將Matrigel膠與無血清培養基按1︰100稀釋，將稀釋液用來浸泡侵襲小室。在侵襲小室上面加入100μl稀釋的基質膠，紫外線消毒殺菌。②小室腔壓力的平衡：在小室的上腔中加入200μl、下腔中加入600μl的無血清培養基，平衡小室腔內的壓力。③侵襲細胞計數：將侵襲小室取出，對膜上的細胞加無水乙醇進行固定，結晶紫染色。將未侵入基質的腫瘤細胞通過棉簽輕輕擦拭掉，未除掉即為已經成功侵入基質膠中的腫瘤細胞，計數10個高倍視野中（×20）侵襲細胞的數目，重復3次，取均值，進行統計分析。

1.8統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，3組均數的比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1miRWalk預測CDH1（E-cadherin）基因的靶miRNAs

采用miRwalk在線程序對CDH1的靶miRNA進行預測，結果發現10個軟件當中有5個以上預測到有20個miRNAs可與CDH1結合（見表1）。

2.2miRanda預測miRNA-CDH1的結合

上述20個靶miRNAs在miRanda軟件當中的熱動力學穩定性分值和序列保守性分值見表2。結果發現，符合條件的miRNAs（熱動力學穩定性分值≤-0.1，序列保守性分值為0.5～0.7）有8個，其中，miR-219-5p與CDH1結合的熱動力學穩定性得分最低，說明miR-219-5p-CDH1之間的結合穩定性最高、特異性最好。

2.3肝癌組織中miR-219-5p與E-Cadherin表達的關系

30例肝癌組織中miR-219-5p平均表達水平低于20例癌旁肝組織，兩者表達的差異有統計學意義；而肝癌組織中E-Cadherin相對表達水平高于癌旁肝組織，經t檢驗，兩者表達差異有統計學意義（t=10.354，P=0.000，見圖1）。說明肝癌組織中出現miR-219-5p低表達和E-Cadherin高表達，而癌旁肝組織中出現miR-219-5p高表達和E-Cadherin低表達。

2.4肝癌細胞中miR-219-5與E-Cadherin表達的關系

分析顯示在高轉移細胞株MHCC97-H中miR-219-5p相對水平低于低轉移細胞株MHCC97-L，高轉移細胞株MHCC97-H中E-Cadherin相對表達水平低于低轉移細胞株MHCC97-L，高轉移細胞株MHCC97-H中N-cadherin相對表達水平高于低轉移細胞株MHCC97-L（見圖2）。說明肝癌細胞中miR-219-5p表達下調，導致E-Cadherin表達下調，miR-219-5p可能通過調控E-Cadherin/N-cadherin的表達水平，與肝癌細胞侵襲轉移有關。

2.5miR-219-5p與E-Cadherin結合驗證

3個重組細胞株HepG2-miR-219-5p mimic、HepG2-miR-NC、HepG2-miR-219-5p-inhibitor中，HepG2-miR-219-5p mimic細胞株中miR-219-5p水平表達增高，而E-Cadherin表達水平下調，N-cadherin高表達；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細胞株中miR-219-5p水平表達下調，而E-Cadherin表達水平上調，N-cadherin低表達（見圖3）。說明轉染miR-219-5p mimic后，miR-219-5p表達水平增高，下調E-Cadherin而N-cadherin上調；而轉染miR-219-5p inhibitor后，miR-219-5p表達水平下調，上調E-Cadherin而N-cadherin下調。說明miR-219-5p能和E-Cadherin的發生結合下調其表達水平，與EMT有關。

表1　預測的20個miRNAs可與CDH1結合

表2　預測的12個miRNAs的熱動力學穩定性和序列保守性得分

圖1　肝癌和癌旁肝組織中miR-219-5p與E-Cadherin表達的關系

圖2　肝癌細胞中miR-219-5p與E-Cadherin、N-cadherin表達關系

2.6miR-219-5p下調E-Cadherin與肝癌侵襲能力變化

Transwell實驗檢測轉染miR-219-5p mimic下調E-Cadherin后，結果顯示，HepG2-miR-219-5p mimic細胞株中侵襲細胞計數為（24±3）個/高倍鏡視野，明顯低于HepG2-miR-NC的（47±5）個/高倍鏡視野、HepG2的（51±5）個/高倍鏡視野，經t檢驗，兩者差異有統計學意義（t=9.952，P=0.003，見表3和圖4）；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細胞株中侵襲細胞計數為（97±8）個/高倍鏡視野，均明顯高于其他3組，經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.856，P= 0.005，見表3和圖4）。

圖34　個細胞系中miR-219-5p與E-Cadherin表達關系

表3　不同肝癌細胞系的侵襲細胞計數

圖4　侵襲實驗檢測不同肝癌細胞系的侵襲能力（×200）

3 討論

惡性腫瘤最顯著的生物學特征是能夠發生轉移，腫瘤細胞的轉移過程是一個多基因、多步驟、多環節的動態變化過程[10]。該過程中涉及到復雜的細胞生物學過程：腫瘤細胞的黏附、侵襲、胞外基質的重塑、腫瘤血管的發生以及機體的免疫狀態發生改變等環節[11]。肝細胞癌的轉移涉及到許多基因和蛋白分子以及轉移相關信號通路的改變[12-14]。該基因和蛋白的調控受許多因素的調控，近年來，有關miRNA調控基因表達與腫瘤侵襲轉移的關系研究已成為腫瘤研究當中的熱點和重點。

EMT是腫瘤發生轉移的主要分子事件之一，是一個復雜的動態發生的過程。其中，細胞骨架的重構是EMT發生的早期事件，主要表現為上皮細胞通過EMT獲得了間質細胞的表型[15]。E-cadherin主要功能是維持細胞間緊密連接的完整性，阻止細胞發生侵襲和轉移擴散，因此，低表達E-cadherin的細胞往往可以誘導EMT的發生[16]。N-cadherin是細胞間黏連的主要結構性成分，其主要功能是介導細胞間的黏附和遷移[17]。

EMT與多種腫瘤的浸潤和轉移相關，EMT是腫瘤侵襲轉移的一個重要步驟，在該過程當中，許多miRNAs分子參與EMT的調節[18-20]。EMT也在肝癌轉移中具有重要作用，然而EMT對肝癌轉移的影響是多方面的。宋瑩等[21]發現，肝細胞生長因子可能通過誘導Snail的表達促進肝癌細胞EMT的發生，與肝癌發生、發展有關。隋承光等[22]發現，過表達miR-100通過抑制mTOR的表達抑制肝癌細胞的遷移及侵襲能力，主要是通過上調E-cadherin的表達，阻抑EMT過程的發生。

miRNA-mRNA之間的相互作用具有嚴格的互補結合的特點，通過相關軟件預測miRNA-mRNA結合，尋找特定的靶基因具有較好的可行性。本研究首先采用miRwalk在線程序，通過多個生物信息學軟件進行聯合檢測，結合多個軟件的檢測結果具有“交集”性，則說明預測的可靠性較好[23]。結果發現，miRwalk在線程序對CDH1的靶miRNA進行預測，結果發現10個軟件當中有5個以上預測到有20個miRNAs可與CDH1結合，符合條件的miRNAs有8個，其中，miR-219-5p與CDH1結合的熱動力學穩定性得分最低，說明miR-219-5p-CDH1之間的結合穩定性最高、特異性最好。

對于生物信息學結果需要進行實驗驗證，本研究發現，30例肝癌組織中miR-219-5p平均表達水平低于20例癌旁肝組織中；而肝癌組織中E-Cadherin相對表達水平高于癌旁肝組織中。同時在肝癌細胞系中，研究發現在肝癌細胞中miR-219-5p表達下調，導致E-Cadherin表達下調，miR-219-5p可能通過調控E-Cadherin/N-cadherin的表達水平，與肝癌細胞侵襲轉移有關。

miR-219-5p是與E-Cadherin（CDH1）是否具有靶向結合，為本研究合成miR-miR-219-5p inhibitor和miR-miR-219-5p mimic以及陰性對照組，分別轉染到肝癌細胞，以觀察miR-miR-219-5p對CDH1的靶向調控作用。結果發現，HepG2-miR-219-5p mimic細胞株中miR-219-5p水平表達增高，而E-Cadherin表達水平下調，N-cadherin高表達；HepG2-miR-219-5p-inhibitor細胞株中miR-219-5p水平表達下調，而E-Cadherin表達水平上調，N-cadherin低表達。說明轉染mimic后，miR-219-5p表達水平增高，下調E-Cadherin而N-cadherin上調；而轉染inhibitor后，miR-219-5p表達水平下調，上調E-Cadherin而N-cadherin下調。miR-219-5p可靶向結合E-Cadherin并下調其表達水平，與EMT有關。

E-cadherin能夠維持細胞間的緊密連接的完整性，阻止細胞發生侵襲和轉移擴散，其表達下調被證明是腫瘤細胞發生侵襲轉移的早期事件，低表達E-cadherin細胞往往可以誘導EMT的發生[24]。N-cadherin是細胞間黏連的主要結構性成分，介導細胞間的黏附和遷移，N-cadherin在上皮惡性腫瘤中的表達往往上調，其高表達往往通過調控EMT而促進腫瘤侵襲和轉移[25]。近年來研究發現E-cadherin/N-cadherin在許多腫瘤中都存在異常表達，說明E-cadherin/N-cadherin在腫瘤的發生、發展以及侵襲轉移中起著重要的作用[26-27]。

本研究發現，轉染miR-219-5p mimic后，miR-219-5p表達水平增高，下調E-Cadherin而N-cadherin上調；而轉染miR-219-5p inhibitor后，miR-219-5p表達水平下調，上調E-Cadherin而N-cadherin下調。同時通過transwell實驗發現，轉染miR-219-5p mimic后侵襲細胞計數明顯低于HepG2-miR-NC、HepG2；轉染miR-219-5p inhibitor后細胞株中侵襲細胞計數明顯高于HepG2-miR-NC、HepG2。說明miR-219-5p上調，下調E-Cadherin而N-cadherin表達增加，抑制肝癌細胞侵襲轉移；而miR-219-5p下調，上調E-Cadherin而N-cadherin表達減少，抑制肝癌細胞侵襲轉移。miR-219-5p靶向E-Cadherin調控EMT在肝癌侵襲轉移中有重要作用，針對E-Cadherin的分子靶向治療在臨床肝癌治療中可能有重要作用。

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（張蕾編輯）

MicroRNA-219-5p regulates EMT and inhibits invasion and metastasis of hepatoma cells by targeting E-cadherin

Li-hui Zhu1，Yong Luo2，Wen-qiu Liao1，Li Zhang1，Guo-qing Li1
（1.Department of Gastroenterology，2.Intensive Care Unit，the Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421001，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of microRNA-219-5p（miR-219-5p）targeting E-cadherin（CDH1）in the regulation of epithelial mesenchymal trasition（EMT），thus inhibiting the invasion and metastasis of hepatoma cells.Methods Bioinformatics methods were used to determine miRNAs with the best specificity and stability of binding to E-cadherin.The correlation between E-cadherin expression detected by Western blot，and miR-219-5p level by qRT-PCR in 30 hepatoma tissues and 20 normal tissues，respectively，was analyzed. miR-219-5p level was detected by qRT-PCR.E-cadherin and N-cadherin levels were detected by Western blot in high and low metastatic hepatoma cell lines.miR-219-5p mimic，inhibitor and negative control were transfected into HepG2 cell line by Lipofectamine 2000，miR-219-5p expression was detected by qRT-PCR and the expressions of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blot.And the effects of miR-219-5p expression change oninvasive and metastatic abilities were also tested by the transwell method.Results Bioinformatics methods showed that miR-219-5p was the best target miRNA with the highest specificity and stability for binding to E-cadherin. miR-219-5p had low expression and E-cadherin had high expression in the HCC，while miR-219-5p had high expression and E-cadherin had low expression in the paracancerous tissues.There were high expression of miR-219-5p，low expression of E-cadherin and high expression of N-cadherin in highly metastatic cell line MHCC97-H. There were low expression of miR-219-5p，high expression of E-cadherin and low expression of N-cadherin in low metastatic cell line MHCC97-L（P＜0.05）.Increased miR-219-5p caused E-cadherin down-regulation and N-cadherin up-regulation.miR-219-5p down-regulation caused E-cadherin up-regulation and N-cadherin down-regulation in HepG2-miR-219-5p-inhibitor cell line（P＜0.05）.The invasion cell count was（24±3）/HP in the HepG2-miR-219-5p mimic cells which was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）. Conclusions miRNA-219-5p can specifically bind to E-Cadherin and regulate the EMT signaling pathway，thus suppress the invasion and metastasis of hepatoma cells.

miRNA；hepatoma；invasion；metastasis；E-cadherin；EMT

R 573.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.18.005

1005-8982（2016）18-0022-08

2016-04-18

羅勇，E-mail：fordluo@qq.com