早期大劑量地塞米松對擠壓綜合征大鼠模型心肌特異性損傷的療效

於四軍，嚴　政，路　靖，金德奎，張　聰，劉惠亮

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早期大劑量地塞米松對擠壓綜合征大鼠模型心肌特異性損傷的療效

於四軍1，嚴政2，路靖1，金德奎1，張聰1，劉惠亮1

目的評估早期大劑量地塞米松對擠壓綜合征大鼠模型心肌特異性損傷的療效。方法將Wistar大鼠隨機分為4組?？瞻?Sham)組、對照(CS)組、生理鹽水(NS)組和地塞米松(DEX)組，每組20只。CS組造模后不做任何處理；DEX組和NS組造模后在解壓前即刻注射1 mg/kg地塞米松和等體積的生理鹽水；Sham組對正常Wistar大鼠無造模及藥物干預，行麻醉、取血和手術處理。各組收集不同時間點的血液和組織學樣本。結果心肌損傷觀察指標：(1)血清cTnI OD值，解壓后3 h各組間差別無統計學意義。6 h時3個處理組血清cTnI均較Sham組顯著上升，CS組為(0.246+0.028)，NS組為(0.202+0.033)，DEX 組為(0.178+0.017)，差異有統計學意義(P<0.01)；NS組和DEX組均低于CS組，NS組和DEX組之間差異無統計學意義。12 h時3個處理組均高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.01)；各處理組間無統計學差異。24 h時CS組和NS組高于Sham組，P<0.05；DEX組與Sham組相比差異無統計學意義；(2)心肌細胞凋亡率CS組、NS組和DEX組各時間點均高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.01)。3 h時NS組和DEX組低于CS組，差異有統計學意義(P<0.01)，NS組和DEX組間差異無統計學意義12～24 h時間段，NS組和CS組差異無統計學意義，DEX顯著低于NS和CS組，差異有統計學意義(P<0.01)；(3) 心肌細胞HE染色 Sham組大鼠心肌組織正常。CS組中可見充血性改變，隨時間加重。NS組和DEX組充血水腫均有不同程度的減輕，DEX組減輕更明顯。結論擠壓綜合征大鼠存在心肌細胞的特異性損傷，大劑量的地塞米松和與之等體積的生理鹽水擴容均能改善這一現象，地塞米松明顯優于生理鹽水單純擴容。大劑量糖皮質激素可能通過抑制全身炎性反應從而減輕擠壓綜合征大鼠的心肌損傷。

擠壓綜合征；大鼠；炎性反應；心肌特異性損傷；地塞米松

擠壓綜合征(crush syndrome，CS)是一類以創傷后循環休克及腎衰竭為特點的危重臨床疾病，在戰爭、交通事故、恐怖襲擊及地震等災難事件中頗為常見。文獻[1,2]報道，地震中CS的發病率可達3%～20%，在高樓坍塌等恐怖事件中則可高達40%。臨床上對CS的認識已有百年，CS的完整病理生理學過程目前仍存在爭議，目前，普遍認為局部受壓導致的橫紋肌溶解后產生的細胞內毒性物質在血流恢復灌注之后，大量入血引起一系列全身性并發癥[3]。文獻[4]表明擠壓綜合征動物模型存在心肌特異性損傷，其機制尚未清楚。另一項研究顯示，大劑量地塞米松通過PI3K-Akt-eNOS通道發揮抗炎作用以及降低缺血再灌注損傷，從而顯著提高了擠壓綜合征大鼠的早期生存率[4,5]。但大劑量糖皮質激素對心肌特異性損傷的影響目前尚無研究報道。本研究通過觀察早期大劑量地塞米松對擠壓綜合征大鼠模型心肌特異性損傷的影響，初步探索心肌損傷的可能機制。

1　材料與方法

1.1造模和分組清潔級雄性Wistar大鼠140只，購于軍事醫學科學院，重320～380 g，飼養于武警總醫院中心實驗室動物房，保持室溫(23±3)℃，相對濕度55%±15%，日光燈照射，每12 h光暗交替。每5只大鼠飼養于1個籠中，自由進食水。參考Isamu Murata等[6]造模方法。將大鼠稱重后腹腔注射0.4 ml/100g水合氯醛麻醉，仰臥放置于動物恒溫毯，設置恒溫37 ℃。采用卡式止血帶作用于大鼠雙后肢，使用彈簧測力計確保壓力恒定為3 kg，連續擠壓5 h后解除壓迫正常飼養。

將Wistar大鼠按照每組保證每個時間點存活5只的原則，分為4組：空白(Sham)組(n=20)，對照(CS)組(n=47)，生理鹽水(NS)組(n=42)和地塞米松(DEX)組(n=25)，CS組造模后不做任何處理；DEX組和NS組分別在解壓前即刻注射1 mg/kg的地塞米松和等體積的生理鹽水；假手術組無造模及藥物干預，余處理相同。4組解壓后均飼養至特定時間點(解除壓迫后3、6、12、24 h)處死并立即獲取血樣和組織樣本。

1.2藥物和試劑地塞米松磷酸鈉注射液(瑞陽制藥有限公司)，水合氯醛溶液(北京軍區總醫院)，生理鹽水(辰欣制藥)，凋亡試劑盒由瑞士羅氏公司(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)提供，大鼠血清肌鈣蛋白Elisa試劑盒(美國lifediagnosis公司，2010-2-HS)。4%多聚甲醛溶液、乙醇、二甲苯、固體石蠟、蘇木精染色等由武警總醫院眼眶病研究所病理實驗室提供。

1.3血清cTnI的測定分離后肢靜脈取3 ml靜脈血2500 r/min,離心20 min取上清液，分裝后-80 ℃冷凍。擇期使用大鼠血清肌鈣蛋白Elisa試劑盒，嚴格按照說明書操作，待反應完全于酶標儀中測量其405 nm吸光度(OD)值。

1.4組織學檢查采血完成后，快速剪開胸部，在心臟仍在跳動的情況下剪取心臟，用生理鹽水洗去血液，置入4%多聚甲醛中固定48 h。橫切取心尖部0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm心室肌，脫水石蠟包埋切片。分別行HE染色以及TUNEL染色[7]，觀對比不同時間點各組的心肌細胞的形態學以及凋亡率情況。

2　結　　果

2.1納入實驗情況實驗共納入大鼠140只，其中麻醉意外死亡6只，未存活至特定時間點54只，最終每個時間點每組均為5只。除去麻醉意外死亡，Sham組共20只大鼠，未存活至特定時間點0只；CS組共47只，未存活至特定時間點27只；DEX組共25只，未存活至特定時間點5只；NS組共42只，未存活至特定時間點22只。每組3、6、12、24 h各入組5例大鼠。

2.2血清cTnI結果血清使用酶聯免疫法中405 nm下的吸光度值，與血清cTnI濃度呈正相關(表1)。解壓后3 h各組間差別無統計學意義。6 h時3個處理組血清cTnI均上升，差異有統計學意義(P<0.01)；組間比較可見NS組和DEX組均低于CS組，P分別小于0.05和0.01，NS與DEX兩組之間無統計學差異。12 h時3個處理組均高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.01)。24 h時間點CS組和NS組仍高于Sham組，P分別小于0.01和0.05，DEX組則與Sham組無統計學差異；NS組和CS組、DEX組組別無統計學差異，而DEX組血清cTnI低于CS組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1各組擠壓綜合征大鼠血清cTnI吸光度(OD值)

組別cTnI吸光度3h6h12h24hSham組0.073±0.0180.052±0.031 0.067±0.0210.074±0.033CS組0.104±0.0240.246±0.028①0.162±0.029①0.147±0.039①NS組0.084±0.0380.202±0.033①③0.150±0.043①0.136±0.020②DEX組0.076±0.0100.178±0.017①④0.134±0.035①0.101±0.042③

注：與Sham組相比，①P<0.01,②P<0.05； 與CS組相比，③P<0.05；④P<0.01

2.3TUNEL染色結果見圖1。心肌細胞凋亡率采用隨機取80個400倍鏡下視野計數陽性細胞率取平均值。CS、NS和DEX組各時間點凋亡率均高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.01)。3組間3 h比較NS組和DEX組明顯低于CS組，但組間比較差異無統計學意義；6 h時NS組和DEX組仍低于CS組，同時DEX組低于NS組，差異有統計學意義(P<0.05)；12～24 h時間段，NS組和CS組差異無統計學意義，但DEX組顯著低于NS組和CS組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1　不同時間點擠壓綜合征大鼠TUNEL染色

表2　不同時間點擠壓綜合征大鼠心肌細胞凋亡率對比　(%)

注：與Sham組相比，①P<0.01,②P<0.05； 與CS組相比，③P<0.01,④P<0.05； 與NS組相比，⑤P<0.01,⑥P<0.05

2.4心肌細胞HE染色結果見圖2。Sham組大鼠心肌組織正常，微細血管、心肌間質完好，細胞核呈卵圓形，位于細胞中央，核膜完整。CS組中可見充血性改變，肌間水腫，少許纖維斷裂，偶可見炎性細胞浸潤，并隨時間加重。NS組和DEX組充血水腫均有不同程度的減輕，DEX組減輕更明顯。

圖2　不同時間擠壓綜合征大鼠心臟組織HE染色

3　討　　論

近年來，擠壓綜合征的研究熱點逐漸從腎臟損傷向多器官衰竭等腎外臟器損傷轉移。多個研究相繼證實擠壓綜合征動物模型存在心肌特異性損傷：血清中可見心肌酶上升，同時病理及免疫組織化學染色存在心肌細胞凋亡[4,8]。Shuiping等[5]研究顯示，大劑量地塞米松通過PI3K-Akt-eNOS通道發揮抗炎作用，從而顯著提高了擠壓綜合征大鼠的早期生存率。然而大劑量地塞米松對心肌細胞特異性損傷的研究至今未見報道。本研究觀察了大劑量地塞米松(DEX)與單純擴容組(NS)、對照組(CS)及空白組(sham)之間心肌特異性損傷指標的差異。結果顯示，在酶學指標上DEX從解壓6 h開始即明顯低于對照組，且至24 h時間點即與正常大鼠無統計學差異，大劑量地塞米松使得心肌酶cTnI的酶峰提前，峰值下降。在組織病理學(HE染色)，變化更為明顯，DEX組各時間點心肌細胞的水腫及炎性浸潤均明顯較輕。在免疫組化(TUNEL染色)指標上，80個40倍視野的DEX組平均凋亡率均明顯降低。同時本研究研究中觀察到，單純擴容(NS組)亦能減輕心肌細胞損傷。

目前尚無研究表明，大劑量糖皮質激素為何能夠減輕CS大鼠心肌細胞特異性損傷。本研究認為，全身炎性反應及低血容量休克是兩個可能原因。炎性反應在擠壓綜合征病理生理中扮演著重要角色，主要在以下三個方面：(1)擠壓及其所致的缺血狀態均可導致中性粒細胞趨化因子含量上升，誘導中性粒細胞聚集產生炎性反應，從而進一步加劇肌細胞的不穩定性；(2)解壓后的再灌注過程產生大量氧自由基及活化的中性粒細胞，活性氧通過激活轉錄因子NF-κB誘導促炎細胞因子基因的表達，而促炎因子TNF、IL-1等通過NADPH氧化酶再次誘導活性氧的生成，從而形成正反饋[9,10]，氧自由基再次誘導細胞溶解的同時，大量的炎性反應介質使毛細血管擴張、通透性增高，加劇血管的損傷以及血流進入肌肉的第三間隙，進一步惡化低血容量狀態；(3)局部的毒性物質、炎性反應因子和氧自由基等進入循環產生全身炎性反應，導致遠端臟器的損傷，最終可致全身多器官衰竭[11]。文獻[5]報道其他疾病導致的全身炎性反應綜合征中也存在心肌細胞損傷。傳統的糖皮質激素在藥理劑量下具有強大的抗炎作用，Murata 等[4]已證實大劑量地塞米松通過PI3K-Akt-eNOS通道降低缺血再灌注損傷以及局部和全身的炎性反應等，從而顯著提高了擠壓綜合征動物模型中的生存率。Rie等[11]報道活性氧與擠壓綜合征的遠端臟器衰竭相關，抗炎作用抑制中性粒細胞的聚集活化，同時減少了進入循環的氧自由基和炎性反應介質的含量，降低遠端臟器的損傷。本研究中大劑量地塞米松能夠顯著改善心肌細胞特異性損傷也是從治療效果這個側面證明，CS大鼠心肌特異性損傷的主要由全身炎性反應引起，并能被強效抗菌藥改善。同時本研究注意到單純擴容的生理鹽水同樣能抑制心肌細胞的凋亡，且在某些時間點地塞米松和生理鹽水對凋亡指標的影響無統計學意義；加之正常大鼠在抽取大量血液后可見心肌細胞凋亡上升，本研究推測低血容量同樣是心臟特異性損傷的原因之一。

全身炎性反應究竟如何導致CS大鼠心肌特異性損傷？本研究結合擠壓綜合征病理生理過程，推測其心臟損傷的原因可能是，擠壓和再灌注期間產生的大量炎性反應介質及氧自由基通過循環到達心臟，使心肌細胞細胞膜處于不穩定狀態，膜通透性上升，代謝毒性物質更易進入心肌細胞；全身炎性反應時，機體處于應激狀態，交感系統興奮，能量消耗加大，部分炎性反應介質促使冠狀動脈痙攣，冠脈血流減少，同時全身的低血容量休克狀態使心肌氧供進一步惡化，從而產生心肌細胞的凋亡。

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(2015-08-11收稿2015-12-11修回)

(責任編輯郭青)

Effect of early stage high-dose dexamethasone on cardiac-specific injury in crush-syndrome rats

YU Sijun1, YAN Zheng2,LU Jing1, JIN Dekui1, ZHANG Cong1, and LIU Huiliang1.

1.Department of Cardiology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,100039 Beijing,China;2.Department of Cardiology, Shouyi District of the 3rd Hospital of Wuhan, 430536 Wuhan, China

ObjectiveTo evaluate the effect of the early stage high-dose dexamethasone on cardiac-specific injury in the crush-syndrome rats.MethodsCS rats were divided into three groups:CS group, NS group and DEX group (n=20 each). DEX group and NS group were intravenously administered 5mg/kg of dexamethasone and an equal volume of nomal saline respectively immediately before reperfusion while CS group received no treatment.A sham group serving as a blank control underwent the same procedures as all the three CS groups except for the compression and decompression and drug intervention. ResultsMyocardial specific injuries: (1) In serum cTnI OD, there were no statistically significant differences between all groups at 3 h after decompression. At 6h, the serum levels of cTnI increased in all three groups (compared with sham group),P<0.01. In NS group and DEX group were significantly lower than in CS group, and thePvalue was smaller than 0.05 and 0.01 respectively. There was no significant difference between DEX and NS groups. At 12 h in all three treatment groups were higher than in sham group (P<0.01).The differences between the three treatment groups were not statistically significant. At 24 h in group CS group and NS group were significantly higher than in sham group,P<0.01 andP<0.05 respectively.There was no significant difference between DEX group and sham group. In DEX group was significantly lower than in CS group,P<0.05. There were no significant differences between NS and DEX group, NS and CS group. (2) Apoptosis rate in myocardium: the apoptosis rate in CS group, NS group and DEX group at each time point were higher than that in sham group,P<0.01. At 3 h in NS group and DEX group were lower than in CS group,P<0.05 andP<0.01, respectively. There was no differences between NS and DEX group. At 6 h in NS group and DEX group were still lower than in CS group,P<0.05 andP<0.01, respectively. In DEX group were lower than in NS group,P<0.05.At 12 h and 24 h, there was no difference between NS and CS group. In DEX group were significantly lower than in NS group,P<0.01. (3) HE staining of myocardium: in sham group was normal. In the CS group, the congestive changes were observed and aggravated along with increasing time. NS group and DEX group had different degree of congestion and edema relief, and the relief in DEX group was more obvious.ConclusionsThere is cardiac specific injury in CS rat model, which may be threated by high-dose dexamethasone and normal saline. High-dose dexamethasone is more effective than an equal volume of normal saline. High dose of glucocorticoid may reduce the myocardial injury in crush syndrome rats through its suppression of systemic inflammatory response.

crush syndrome; rats; inflammation; cardiac-specific injury; dexamethasone

於四軍，博士，主治醫師。

1.100039北京，武警總醫院心內科，2.430536，武漢市第三醫院心內科

劉惠亮，E-mail:lhl518@vip.sina.com

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