白藜蘆醇對人急性T淋巴細胞白血病的體外治療作用及其機制

馬麗君，姜中興，田文亮，何琛，郭榮，孫慧，孫玲，李英梅

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052)

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·論著·

白藜蘆醇對人急性T淋巴細胞白血病的體外治療作用及其機制

馬麗君，姜中興，田文亮，何琛，郭榮，孫慧，孫玲，李英梅

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052)

目的探討白藜蘆醇對人急性T淋巴細胞白血病的體外治療作用及其機制。方法 以人T淋巴細胞白血病細胞(Hut78)作為白藜蘆醇的作用靶細胞，分別用6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L白藜蘆醇處理Hut78細胞24 h，用100 μmol/L白藜蘆醇處理Hut78細胞12、24、48 h, 采用CCK-8法測算細胞抑制率。經100、200 μmol/L白藜蘆醇分別處理Hut78細胞12、24 h后，用流式細胞術分析Hut78細胞的凋亡情況。 Hut78細胞經100、200 μmol/L白藜蘆醇處理48 h,采用Western blotting法檢測細胞中C-myc蛋白的表達。結果 白藜蘆醇在大于6.25 μmol/L時顯著抑制Hut78細胞的增殖，并呈劑量-時間依賴性(P均<0．01)。白藜蘆醇可誘導Hut78細胞凋亡，隨濃度增加凋亡細胞增多(P均<0．01)。白藜蘆醇可呈劑量依賴性下調C-myc蛋白表達(P均<0．01)。結論 白藜蘆醇有明顯的體外抗人急性T淋巴細胞白血病效應，其作用機制可能與下調C-myc蛋白表達有關。

T淋巴細胞白血病；白藜蘆醇；細胞增殖；細胞凋亡；C-myc蛋白

白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄科植物中的多酚類物質，其化學名稱為芪三酚，是反式-3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯，分子式結構為C12H14O3，在我國中藥虎杖中有較高的含量，其有較好的抗炎、調節血脂、抑制血小板聚集及保護心血管等多種作用。自Jang等[1]系統地報道了白藜蘆醇對腫瘤的抑制作用后，多種癌細胞株研究中已證實，白藜蘆醇通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡發揮抗癌作用[2～5]。2014年6月～2015年10月，我們通過體外實驗觀察白藜蘆醇對Hut78細胞株增殖及凋亡的影響，并從分子生物學角度探討白藜蘆醇用于治療白血病的可能性及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料白血病細胞Hut78細胞株(購自上海生命工程院)、白藜蘆醇(純度為99%，購自美國Sigma公司，批號為R5010)、二甲基亞砜(DMSO，購自美國Sigma公司)、DMEM高糖培養基(購自美國HyClone公司)、小牛血清(購自美國GEMINI公司)、 CCK-8試劑盒(購自日本同仁公司)、 細胞培養CO2孵育箱、異硫氰酸熒光素及碘化丙啶雙標記膜聯蛋白(Annexin-V、PI，購自上海貝博生物公司)、C-myc抗體(購自abcam公司)、β-actin(購自北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2細胞培養Hut78細胞常規培養于含10%的胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的DMEM高糖培養基中。置于飽和濕度，37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。常規換液傳代培養，選擇對數生長期的細胞進行試驗。

1.3細胞分組及處理 取對數生長期細胞，將細胞濃度調整至1×104/mL接種于96孔板，180 μL/孔，設立空白對照組(只含培養基，不含藥物及細胞)、陰性對照組(含細胞懸液，不含藥物)和實驗組，每組設5個復孔。將白藜蘆醇溶解于二甲基亞砜中，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃凍存備用。用時將儲存液逐漸加入至培養基中稀釋至所需濃度。實驗組分別加入含有不同濃度的白藜蘆醇20 μL，使其終濃度為6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L，充分混勻(并使DMSO終濃度不高于0.1%，此濃度對細胞生長無影響)。對照組加入等體積的培養基或細胞懸液。

1.4細胞抑制率的測算采用CCK-8法。將各組細胞置于培養箱中繼續培養24 h，然后加入20 μL CCK-8繼續培養4 h,于酶標儀450 nm處測定A值，計算細胞抑制率及半數抑制濃度(IC50)。取IC50分別作用于細胞12、24、48 h,計算細胞抑制率。細胞抑制率=[1-(白藜蘆醇組A值-空白對照組A值/陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.5 細胞凋亡率的測算采用Annexin-V法。調整細胞終濃度為2×105/mL，以終濃度100、200 μmol/L的白藜蘆醇培養細胞，空白組加入等體積的DMEM培養基，培養24、48 h后收集細胞，以PBS進行洗滌，離心棄上清加入緩沖液，輕輕振蕩重懸細胞，加入FITC標記的Annexin-V于4 ℃冰箱避光孵育15 min，加入PI避光染色5 min后，經流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。Annexin-V陰性、PI陰性代表正常細胞，Annexin-V陽性、PI陰性代表凋亡早期的細胞，Annexin-V陽性、PI陽性代表凋亡晚期的細胞。

1.6細胞C-Myc蛋白表達的檢測采用Western blotting法。取對數生長期細胞分別加入100、200 μmol/L的白藜蘆醇進行培養，并設置對照組(無藥物干涉組)，培養48 h后離心收集細胞，以預冷的PBS洗滌細胞3次，將細胞置于冰上，加入適量的細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，30 min后離心收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液置于沸水中煮沸5 min變性。變性后以每孔30 μL點樣，經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離,通過電轉將凝膠上蛋白樣品轉移至PVDF膜上，加入相應一抗4 ℃冰箱孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，ECL試劑盒顯影，最后進行圖片掃描，利用Image J軟件分析每條蛋白條帶的灰度值，并與相對應內參值相比對。計算相對表達量。各實驗組重復3次。

2　結果

2.1白藜蘆醇對白血病細胞生長的抑制作用干預24 h后，陰性對照組A值為1.108±0.003，空白對照組A值為0.308±0.004。加入6.25、12.5、25、50、100 、200 μmol/L白藜蘆醇后經酶標儀測得A值為1.104±0.003、0.874±0.004、0.798±0.004、0.749±0.002、0.692±0.002、0.605±0.004，細胞抑制率分別為0.5%、29.3%、38.6%、44.9%、52.0%、62.9%。白藜蘆醇作用于細胞24 h時與陰性對照組比較，6.25 μmol/L 白藜蘆醇作用于Hut78細胞未顯示明顯的抑制作用(P>0．05 ),12.5 ～ 200 μmol/L 白藜蘆醇對Hut78細胞均具有顯著的體外增殖抑制作用，且隨藥物濃度增加，抑制率增加(P均<0．01)。對細胞培養24 h后最高抑制率為62.9%，白藜蘆醇作用于Hut78細胞24 h后的IC50為98.7 μmol/L。取100 μmol/L白藜蘆醇作用于細胞12、24、48 h后，A值分別為0.811±0.001、0.691±0.001、0.582±0.002，相應抑制率分別為30.6%、51.7%、65.8%，隨時間延長細胞抑制率升高(P均<0．01)，白藜蘆醇對白血病細胞增殖抑制率在一定范圍內呈劑量-時間依賴性。

2.2白藜蘆醇對Hut78細胞凋亡的誘導作用藥物處理細胞24 h后，100 μmol/L 白藜蘆醇作用下細胞早期凋亡率為44.3%，晚期凋亡率為10.1%;200 μmol/L 白藜蘆醇作用下細胞早期凋亡率為48.3%，晚期凋亡率為15.6%。總凋亡率分別為54.4%、63.9%。藥物處理細胞48 h后，100 μmol/L白藜蘆醇作用下細胞早期凋亡率為49.7%、晚期凋亡率為29.2%;200 μmol/L白藜蘆醇作用下細胞早期凋亡率為45.2%、晚期凋亡率為46.7%。總凋亡率分別為78.9%、91.9%。白藜蘆醇以濃度依賴性誘導細胞凋亡(P均<0.01)。

2.3Hut78細胞C-myc蛋白的表達Hut78細胞經0、100、200 μmol/L白藜蘆醇作用48 h,白血病細胞C-myc蛋白相對表達量分別為0.414±0.102、0.212±0.137、0.020±0.002，不同濃度間比較，P均<0.01。

3　討論

急性白血病是一種造血系統的惡性病變，常表現為白血病細胞在骨髓及其他造血組織中異常增生。白血病的常規治療方法主要為化療，但由于目前藥物缺乏特異性選擇，在殺傷腫瘤細胞的同時，一定程度上也造成正常組織、器官等的功能或器質性損傷(尤其是骨髓和消化道)，不良反應較大。另外，由于耐藥性現象，降低了治療成功率。白藜蘆醇作為中藥成分，通過一些復雜的過程，可以選擇一些敏感細胞進行治療并誘導凋亡[6]。由于白藜蘆醇對骨髓造血系統毒性較小，在治療白血病中具有潛在的優越性。在三氧化二砷治療急性早幼粒細胞白血病的研究中，聯合使用白藜蘆醇可協同抗白血病并降低不良反應[7]。本研究經過體外實驗研究發現，白藜蘆醇對白血病細胞具有較好的增殖抑制及誘導凋亡作用，其增殖抑制率在一定范圍內呈劑量-時間依賴性，與李覃等[8]研究結論相符合。另有研究報道白藜蘆醇可改變白血病細胞生長周期[9]，而細胞增殖大多是由DNA合成的開始階段細胞周期G1→S期所控制，其是阻斷細胞增殖的關鍵時期[10]。因白藜蘆醇對不同腫瘤生長周期分布影響不同，其機制尚不明確，有待進一步研究。

C-myc蛋白是由C-myc基因編碼表達的，屬于核蛋白，在調節細胞生長、分化及惡性轉化中發揮作用。相關研究表明，在很多腫瘤中可以檢測到C-myc基因的擴增，并時常伴隨著基因表達的上調，C-myc蛋白的過度表達常作為預后不良的標志。在造血干細胞中，C-myc蛋白在控制造血干細胞自我更新與分化中起著重要作用，保持造血系統自我更新和分化的平衡，在骨髓中C-myc過度表達將導致白血病細胞惡性增殖。C-myc蛋白表達增高在急性髓系白血病和急性T淋巴細胞白血病中均可觀察到。近年研究發現，C-myc蛋白除了參與促進細胞增殖外，還參與誘導細胞凋亡。C-myc基因是一個終末分化的負性調節因子，在大多數正常增殖細胞中均有表達，而當細胞終末分化時表達下調。在增殖活躍的細胞及腫瘤細胞中大多都有C-myc的異常表達。C-myc蛋白具有調節細胞增殖與凋亡的雙重功能，且實現兩種生物學效應的分子結構區域完全相同。C-myc基因表達的失調是多種細胞凋亡的主要誘因，細胞發生凋亡的速度及其對誘導因素的敏感性均依賴于細胞C-myc蛋白的含量。在一些腫瘤細胞經白藜蘆醇處理后，出現細胞分化和凋亡現象的同時，還伴有C-myc表達的下調。另有研究報道，在急性髓系白血病的治療中，C-myc的高表達是耐藥白血病細胞的細胞遺傳學特征[10]。而目前已有實驗證實白藜蘆醇可通過多種途徑抑制白血病細胞增殖并誘導凋亡。本實驗中，隨著白藜蘆醇濃度的增加，C-myc蛋白表達明顯減少，提示這可能是誘導白血病細胞凋亡的機制之一。

本文通過體外實驗發現，白藜蘆醇具有良好的抗白血病效應，但其具體機制較為復雜，各信號傳導通路交互影響，因而其抗白血病機制仍需進一步闡明；且由于白血病細胞類型較多，白藜蘆醇對各類型細胞作用不一，敏感性不同，這些問題都需要進一步研究。總之，加強對白藜蘆醇抗白血病機制的研究，有可能提供新的臨床治療方案。

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Therapeutic effect and mechanism of resveratrol on human T lymphatic leukemia cells

MALijun,JIANGZhongxing,TIANWenliang,HEChen,GUORong,SUNHui,SUNLing,LIYingmei

(TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and mechanism of resveratrol (Res) on human T lymphatic leukemia cells (Hut78) . MethodsHuman T lymphocytic leukemia (Hut78) cells were selected as the target cells, which were treated with 6.25, 12.5, 25, 50, 100 and 200 μmol/L Res, respectively. CCK-8 assay was used to detect the cell inhibition rate of Hut78 cells which were treated with 100 μmol/L Res for 12, 24 and 48 h, respectively. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of Hut78 cells which were respectively treated with 100 and 200 μmol/L Res for 12 and 24 h. Western blotting was used to detect the expression of C-myc protein in Hut78 cells which were respectively treated with 100 and 200 μmol/L Res for 48 h.Results Resveratrol whose dose was greater than 6.25 μmol/L significantly inhibited the proliferation of Hut78 cells, and was time- and dose-dependent (allP<0.01). Res induced the apoptosis of Hut 78 cells, which was dose-dependent (allP<0.01). Res own-regulated the expression of C-myc protein which was in a dose-dependent manner (allP<0.01).Conclusion Resveratrol has significant anti-leukemia effect on human T lymphatic leukemia, and its mechanism may be associated with the down-regulated expression of C-myc protein.

T lymphatic leukemia; resveratrol; cell proliferation; apoptosis; C-myc protein

國家自然科學基金資助項目(81070445);河南省醫學科技攻關項目(20090349)。

馬麗君(1986-)，女，碩士，主要從事血液病基礎與臨床研究。E-mail:malijun998@163.com

簡介：姜中興(1965-)，男，教授，主要從事血液病基礎與臨床研究。E-mail:jiangzx313@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.001

R733.7

A

1002-266X(2016)29-0001-03

2016-03-08)