丹參總酚酸對(duì)刀豆蛋白A所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

何佳麗,劉焱,溫韜

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心)

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丹參總酚酸對(duì)刀豆蛋白A所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

何佳麗1,劉焱1,溫韜2

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心)

目的研究丹參總酚酸對(duì)刀豆蛋白A(ConA)所致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 將野生型C57BL/6 (B6)雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、丹參總酚酸組、ConA組和丹參總酚酸+ConA組。ConA組小鼠通過(guò)尾靜脈注射ConA(40 mg/kg)誘導(dǎo)肝損傷；丹參總酚酸+ConA組小鼠先經(jīng)腹腔注射丹參總酚酸溶液(50 mg/kg)，30 min后再給予相同劑量的ConA；正常對(duì)照組僅尾靜脈注射生理鹽水，丹參總酚酸組僅腹腔注射丹參總酚酸溶液，劑量同上。干預(yù)16 h后，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)肝功能，應(yīng)用HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化，應(yīng)用ELISA和Luminex方法檢測(cè)細(xì)胞外組蛋白及相關(guān)炎癥分子(IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α)的水平。結(jié)果小鼠尾靜脈注射ConA后發(fā)生了明顯的肝損傷，表現(xiàn)為血漿ALT、AST水平顯著升高，大量肝細(xì)胞凋亡壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；給予丹參總酚酸干預(yù)能顯著減輕小鼠肝損傷，降低ALT、AST水平。與正常對(duì)照組或丹參總酚酸組相比，ConA組的細(xì)胞外組蛋白、IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α水平均升高(P均<0.01)；與ConA組比較，丹參總酚酸+ConA組小鼠各指標(biāo)均降低(P均<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組或丹參總酚酸組(P均<0.01)。結(jié)論 丹參總酚酸對(duì)ConA所致的小鼠急性肝損傷有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞外組蛋白和相關(guān)的細(xì)胞因子水平有關(guān)。

肝損傷；丹參總酚酸；刀豆蛋白A；炎癥因子

丹參為唇型科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、安神滋補(bǔ)和通經(jīng)活血功效，在臨床上應(yīng)用廣泛，可用于治療心腦血管疾病、消化系統(tǒng)疾病和各種腫瘤等[1,2]。丹參總酚酸是丹參的水提物成分，具有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，是丹參發(fā)揮作用的主要活性成分。近年研究發(fā)現(xiàn),丹參總酚酸具有抑制血小板聚集、抗凝、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎作用，其藥理作用明顯優(yōu)于丹參[3～5]。2015年3～8月，本研究擬通過(guò)制備刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，探討丹參總酚酸是否對(duì)炎癥性肝損傷具備保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料動(dòng)物：10周齡C57BL/6(B6)雄性小鼠，體質(zhì)量20～28 g，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)動(dòng)物部并由其負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，自由飲水，室溫18～22 ℃，濕度為50.0%±2.0%，每隔12 h開(kāi)燈照明，飼養(yǎng)1周后使用，實(shí)驗(yàn)前12 h和實(shí)驗(yàn)期間禁食。主要試劑及儀器：丹參總酚酸由北京大學(xué)藥學(xué)院姜濤教授惠贈(zèng)，純度>98%。ConA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞外組蛋白ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物有限公司(USCN Life Science)；Luminex檢測(cè)系列細(xì)胞因子試劑盒為美國(guó)Affymetrixe Bioscience公司產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物分組和模型制備首先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成正常對(duì)照組(n=6)、丹參總酚酸組(n=6)、ConA組(n=14)和丹參總酚酸+ConA組(n=10)。參考文獻(xiàn)[6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行造模：染毒組小鼠經(jīng)尾靜脈注射ConA(40 mg/kg)建立急性肝損傷模型，丹參總酚酸+ConA組小鼠先按50 mg/kg劑量腹腔注射丹參總酚酸溶液，30 min后再對(duì)小鼠尾靜脈注射相同劑量的ConA；對(duì)照組小鼠尾靜脈只注射生理鹽水，丹參總酚酸組小鼠腹腔只注射丹參總酚酸，干預(yù)劑量同上。

1.3小鼠一般情況及肝組織病理學(xué)觀察各組小鼠一般情況，包括活動(dòng)、毛色、精神變化以及死亡等情況。各組于干預(yù)后16 h處死，取小鼠肝組織于10%甲醛溶液固定24 h以上，用石蠟包埋，制備5 μm切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織損傷情況。

1.4小鼠肝功能測(cè)定干預(yù)16 h后取小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈血，加EDTA抗凝后于3 000 g 離心10 min后分離血漿，于-80 ℃凍存待測(cè)。采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7180)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。

1.5血漿細(xì)胞外組蛋白水平測(cè)定采血方法同上。采用ELISA法測(cè)定小鼠血漿中細(xì)胞外組蛋白水平，具體操作方法參見(jiàn)說(shuō)明書。

1.6血漿細(xì)胞因子水平測(cè)定采用高效液相芯片系統(tǒng)(Luminex)測(cè)定小鼠血漿中細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α)水平，具體操作方法參見(jiàn)使用說(shuō)明書。

2　結(jié)果

2.1各組大體表現(xiàn)及肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)正常對(duì)照組和丹參總酚酸組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，毛色有光澤，實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)生死亡；ConA組小鼠出現(xiàn)飲食、活動(dòng)量減少、精神萎靡等，染毒后16 h內(nèi)有6只小鼠先后死亡；丹參總酚酸+ConA組小鼠在染毒16 h內(nèi)先后死亡2只。正常對(duì)照組小鼠肝體積正常，呈鮮紅色，表面光滑、邊緣整齊；組織切片顯示肝細(xì)胞、匯管區(qū)、膽管上皮細(xì)胞等形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等；ConA組小鼠16 h時(shí)病理學(xué)顯示有大量肝細(xì)胞變性腫脹，肝小葉內(nèi)有不同程度的細(xì)胞凋亡及壞死，匯管區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；丹參總酚酸+ConA組小鼠的肝損傷得到了明顯改善，表現(xiàn)為變性壞死的肝細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞均減少，僅見(jiàn)到少數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)混濁腫脹，且多為散在分布；匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但均明顯少于ConA染毒組。

2.2各組ALT、AST比較見(jiàn)表1。

表1　各組ALT、AST比較

注：與正常對(duì)照組或丹參總酚酸組相比，*P<0.01；與ConA組相比，#P<0.01。

2.3各組細(xì)胞外組蛋白和細(xì)胞因子水平比較見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組或丹參總酚酸組相比，ConA組的細(xì)胞外組蛋白、IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α水平均升高(P均<0.01)；與ConA組比較，丹參總酚酸+ConA組小鼠各指標(biāo)均降低(P均<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組或丹參總酚酸組(P均<0.01)。

表2　各組細(xì)胞外組蛋白和細(xì)胞因子水平比較±s)

注：與正常對(duì)照組或丹參總酚酸組相比，*P<0.01 ；與ConA組相比，#P<0.01。

3　討論

大量研究表明，炎癥反應(yīng)是啟動(dòng)和加重急性肝損傷的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)早期給予有效手段干預(yù)炎癥因子生成，可能有助于減輕肝損傷和阻止病程進(jìn)展[6,7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參總酚酸具有抑制血小板聚集、抗凝、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基作用[3,4]；特別是丹參總酚酸能抑制NADPH氧化酶，減慢受刺激細(xì)胞的“呼吸爆發(fā)”，減少氧自由基產(chǎn)生，對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用，因此廣泛應(yīng)用于抗氧化性損傷。

丹參總酚酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧性損傷有明顯保護(hù)作用，對(duì)化學(xué)性急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的防治也具顯著效果，其作用機(jī)制與顯著降低自由基生成有關(guān)。研究亦發(fā)現(xiàn)，丹參總酚酸有明顯的抗炎作用，但目前尚不清楚此種抗炎效應(yīng)的具體機(jī)制。為了深入探討和開(kāi)發(fā)丹參總酚酸的生物學(xué)特性，本次研究中，我們制備了ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型，探討丹參總酚酸是否能減輕肝臟炎性損傷及相關(guān)的作用機(jī)制。與四氯化碳和對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的以氧化性損傷為主的肝損傷模型不同，ConA的作用機(jī)制是通過(guò)特異性結(jié)合肝細(xì)胞膜，招募并激活大量T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)釋放多種細(xì)胞因子，造成炎癥性肝損傷。ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷模型和人類病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等的病理特點(diǎn)非常相似，常用于探討臨床藥物的療效和機(jī)制分析。

本研究結(jié)果顯示，給予小鼠尾靜脈注射ConA能誘導(dǎo)典型的肝損傷，表現(xiàn)為肝功能指標(biāo)(ALT、AST)異常升高，并伴有明顯的組織病理學(xué)改變；而給予丹參總酚酸干預(yù)后，染毒小鼠的肝損傷癥狀得到顯著改善，表現(xiàn)為血漿ALT、AST水平降低、肝細(xì)胞損傷程度及范圍均明顯減輕。這一結(jié)果表明，丹參總酚酸有很明顯的抗炎作用，對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠炎癥性肝損傷亦有明確的保護(hù)作用，但其機(jī)制與丹參總酚酸的抗氧化能力無(wú)關(guān)。

細(xì)胞外組蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥介質(zhì)，已證實(shí)在啟動(dòng)和加重肝臟炎癥損傷性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[7,8]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外組蛋白在嚴(yán)重感染(如膿毒血癥)時(shí)顯著升高；大量的細(xì)胞外組蛋白可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，激活炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子釋放，加重組織細(xì)胞損傷甚至導(dǎo)致死亡；給予特異性抗組蛋白抗體中和循環(huán)中的游離組蛋白，能有效降低致死率，減輕炎癥反應(yīng)。Huang等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外組蛋白在體內(nèi)主要經(jīng)Toll樣受體信號(hào)通路激活天然免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。更多新的研究表明，細(xì)胞外組蛋白不僅有直接的細(xì)胞毒性作用，還可作為損傷模式相關(guān)分子促進(jìn)下游細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α等釋放，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。這些研究提示，細(xì)胞外組蛋白不僅可作為反映疾病嚴(yán)重程度的特異性標(biāo)志物，還可望成為分子標(biāo)靶用于臨床干預(yù)治療。本研究結(jié)果顯示，ConA染毒后小鼠細(xì)胞外組蛋白水平顯著升高，并伴有相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α明顯升高，給予丹參總酚酸干預(yù)有效降低了細(xì)胞外組蛋白和細(xì)胞因子水平。由此可見(jiàn)，丹參總酚酸對(duì)肝損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制細(xì)胞外組蛋白及相關(guān)細(xì)胞因子水平而實(shí)現(xiàn)的。

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Protective effect of salvianolic acids on acute liver injury caused by concanavalin A in mice

HEJiali1,LIUYan,WENTao

(1BeijingYou-AnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of salvianolic acids on acute liver injury caused by concanavalin A (ConA) in mice and its mechanism. Methods Male C57BL/6 (B6) mice were randomly divided into four groups: the normal control group, which received saline only; salvianolic acids-treated group, which received salvianolic acids only; ConA-treated group, which was administered with ConA (40 mg/kg) via tail vein injection; and the salvianolic acids+ConA-treated group, which received salvianolic acids at a dose of 50 mg/kg 30 min prior to ConA injection. After 16-hour intervention, the liver function was analyzed by fully automatic biochemical analyser, pathologic changes were observed by HE staining, and the relevant inflammatory mediators (extracellular histones, IL-1 , IL-6, IL-18 and TNF-α) were evaluated by ELISA and Luminex. ResultsThe administration of ConA to mice caused severe liver injury, as evidenced by significantly increased ALT and AST levels, necrosis and apoptosis of liver cells and inflammatory cell infiltration. Compared with the ConA-treated mice, salvianolic acids plus ConA-treated mice showed a significantly decreasing trend of ALT, AST, as well as the reduced liver injury. Besides, the concentrations of extracellular histones, IL-1 , IL-6, IL-18 and TNF-α were significantly decreased in the ConA-treated group as compared with those of the normal control group and salvianolic acids-treated group (allP<0.05). Compared with the ConA-treated group, all indexes of the salvianolic acids+ConA-treated group were decreased (allP<0.01), but were higher than those of the normal control group and salvianolic acids-treated group (allP<0.01).ConclusionSalvianolic acids have significant protective effect on ConA-induced liver injury in mice, likely due to its ability of decreasing the levels of extracellular histones and various cytokines.

liver injury; salvianolic acids; concanavalin A; inflammatory factors

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372094)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目-學(xué)科骨干(2013-3-077)。

何佳麗(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦尾〉闹委熀透深A(yù)。E-mail: springmaze@sina.com

簡(jiǎn)介：溫韜(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠装Y性疾病的機(jī)制和干預(yù)。E-mail: wentao5281@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.002

R657.3

A

1002-266X(2016)29-0004-03

2016-01-15)