齊墩果酸聯合二甲亞砜對糞腸球菌的抑制作用

吳悠，胡焱，王瑤

(1西南醫科大學口頜面修復重建和再生實驗室，四川瀘州 646000；2 西南醫科大學附屬口腔醫院)

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齊墩果酸聯合二甲亞砜對糞腸球菌的抑制作用

吳悠1，胡焱1，王瑤2

(1西南醫科大學口頜面修復重建和再生實驗室，四川瀘州 646000；2 西南醫科大學附屬口腔醫院)

目的探討齊墩果酸與二甲亞砜聯合對糞腸球菌的抑制作用，以及在糞腸球菌感染根管模型中的抑菌效果。方法 分別測定二甲亞砜、齊墩果酸的最小抑菌濃度值(MIC)，采用微量棋盤液體稀釋法測定聯合時對糞腸球菌的抑菌效果，計算抑菌濃度分數指數(FICI)。建立離體牙糞腸球菌感染根管模型，隨機分為3組，分別用1 mg/mL齊墩果酸+50%二甲亞砜(A組)、2%洗必泰(B組)、去離子水(C組)根管內封藥，封藥前及封藥1 h、24 h、7 d分別取樣進行細菌培養計數，并進行統計學分析。結果 二甲亞砜對糞腸球菌的MIC為20%，齊墩果酸對糞腸球菌的MIC為100 μg/mL。齊墩果酸聯合二甲亞砜FICI為0.512 5。3組處理后比處理前細菌數量均有減少，A、B組差異均具有統計學意義(P均<0.05)；A組所需作用時間較B組稍長，1 h兩者菌落數比較差異有統計學意義(P<0.05)，24 h、7 d均能完全抑制根管內糞腸球菌生長，比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 齊墩果酸與二甲亞砜聯合對體外糞腸球菌的抗菌作用表現為相加作用，二者聯合應用可有效抑制根管內糞腸球菌生長。

糞腸球菌;齊墩果酸；二甲亞砜

糞腸球菌是再感染根管、患有難治性根尖周炎根管中最常檢測到的細菌[1]。目前常用的根管消毒藥物對于抑制根管內糞腸球菌生長的有效性、安全性尚不能達到較為理想的效果。齊墩果酸(OA)是女貞子的主要有效成分，別名土當歸酸。其大部分以游離酸或糖苷的形式存在，為齊墩果烷型五環三萜類化合物，分子式為C30H48O3。作為一種天然藥物，其毒性很低，具有多種生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、護肝等。研究[2～5]發現，OA能夠抑制多種口腔病原菌的生長，其中包括糞腸球菌，有成為理想的根管消毒藥物的可能性。二甲亞砜(DMSO)作為一種有機溶劑，能夠增強藥物的滲透性，對生物膜的滲透作用好，且其本身也具有抗菌作用，是研究OA常用的賦形劑。但是，DMSO聯合OA對糞腸球菌的聯合藥敏效果尚未得到證實。因此，本研究將OA溶于DMSO，采用倍比稀釋法、微量棋盤稀釋法、菌落計數法研究兩種藥物聯合抑制浮游態糞腸球菌的效果，以彌補以往研究的不足；并進一步研究其能否抑制離體牙感染根管內糞腸球菌生長，探討其用于治療糞腸球菌感染根管的可能性。

1　材料與方法

1.1材料糞腸球菌標準菌株ATCC 29212(四川大學華西口腔醫學中心實驗室)；腦心浸液(BHI)液體培養基(杭州百思生物技術責任有限公司)；OA分析純(綿陽東方源生物科技有限公司)；2%醋酸氯己定(上海麥克林生化科技有限公司)；DMSO分析純(北京索萊寶科技有限公司)；API 20strep鏈球菌試劑盒(梅里埃，法國)；96孔板(Costar，美國)；電子分析天平(Sartorius，德國)；麥氏比濁儀(Biomerieux SA，法國)；高壓蒸汽滅菌消毒器(松下健康醫療器械株式會社，日本)；JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠)；YQX-Ⅱ厭氧培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)。

1.2菌株的復蘇活化從凍存管中取出糞腸球菌接種于有適量滅菌BHI液體培養基的無菌試管，置于37 ℃的厭氧培養箱(80% N2,10% H2,10% CO2)內復蘇培養24 h。經兩次傳代后，細菌進入茁壯期。比濁儀調整菌液濃度至1.5×108CFU/mL，1∶100生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL。

1.3DMSO和OA的最小抑菌濃度(MIC)測定采用試管液體倍比稀釋法測定DMSO對糞腸球菌的MIC值。最終1～7號試管中DMSO濃度分別為80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%。8號試管為陰性對照，不含DMSO，僅加入菌液+BHI液體培養基。9號試管為空白對照，僅含BHI液體培養基。取菌懸液100 μL即刻接種于1～8號試管中，置于37 ℃厭氧條件下孵育培養48 h。實驗重復3次。培養結束后肉眼觀察判定結果，從無菌生長的各管中找出最低藥物濃度的試管，該管的藥物濃度即為MIC。采用平板瓊脂稀釋法測定OA對糞腸球菌的MIC值。藥物稀釋的方法同液體倍比稀釋法。將OA分析純加入低濃度的DMSO(5%)做系列倍比稀釋后，1～6號平皿中OA終濃度分別為250、200、150、100、50、10 μg/mL。7、8號平皿為陰性對照，7號不含OA，僅加入5% DMSO、菌液的BHI瓊脂培養基共30 mL。8號平皿為僅加入菌液的BHI瓊脂培養基30 mL。菌懸液于瓊脂平皿表面劃線接種，倒置培養于37 ℃厭氧箱內48 h。實驗重復3次。培養結束后肉眼觀察判定結果，菌落生長被完全抑制的最低藥物濃度即為OA對待測菌的MIC(μg/mL)。單一菌落生長可忽略不計。

1.4抑菌濃度分數指數(FICI)的測算 采用微量棋盤稀釋法。無菌96孔板中OA從橫排加入，DMSO從縱排加入。OA的終濃度分別為200、150、100、50、10、5、2.5、1.25 μg/mL，DMSO的終濃度分別為30%、25%、20%、15%、10%、5%。將OA粉末充分溶解于DMSO后，以BHI液體培養基定容，各濃度梯度藥液搖勻備用。OA和DMSO按照濃度由高到低分別加入1～8豎列和A～F橫行，各孔均加入藥液100 μL。加入預備好的菌液100 μL。第9列為陰性對照，A～F行每孔均加入BHI液體培養基100 μL和菌液100 μL。將96孔板置于37 ℃厭氧培養箱中培養48 h后，觀察結果。實驗重復3次。聯合用藥效果評價：根據聯合藥敏管與單獨藥敏管的抑菌情況計算FICI。FICI=甲藥聯合時MIC/甲藥單獨時MIC+乙藥聯合時MIC/乙藥單獨時MIC。當FICI≤0.5時為協同作用，0.52時為拮抗作用。

1.5離體牙樣本制備收集2015年1～5月西南醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科門診因正畸需要或牙周病而拔除的新鮮單根管恒牙共計45顆，要求根尖孔均發育完全，無近髓齲壞或充填體，未做過牙髓治療，無根裂等缺陷。自釉牙骨質界下使用慢速切鋸在流水冷卻下截除牙冠部分，根管標準化長度為10 mm，Mtwo鎳鈦銼預備至30#，17%乙二胺四乙酸浸泡根管2 min，超聲振蕩，最后5.25%NaClO浸泡根管2 min，超聲振蕩。3M流體樹脂封閉根尖孔。將牙根浸泡于盛有無菌BHI液體培養基1 mL的Eppendoff管中，在121 ℃、1.5 MPa高溫高壓條件下滅菌15 min，隨機選取5個標本用以檢測滅菌效果。

1.6感染根管模型的建立取菌懸液100 μL，注入各根管內后將標本放入含BHI液體培養基1 mL的無菌EP管中，在30 min內接種完畢。將所有樣本放入厭氧培養箱內37 ℃厭氧培養，隔日更新BHI培養基至21 d。第21天時，用API 20strep試劑盒對根管內細菌進行細菌菌種鑒定，鑒定結果為糞腸球菌且無其他雜菌污染，證明糞腸球菌感染根管模型建立成功。

1.7分組處理、菌落計數將根管內糞腸球菌感染模型隨機分為A、B、C組，每組15個樣本。分別用注射方法將1 mg/mL OA+50% DMSO、醋酸氯己定液、去離子水注滿各根管內，直至液體溢出為止。上述操作均在無菌條件下進行。MD-Temp暫封后，將3組標本置于厭氧培養箱中培養，分別于1 h、24 h、7 d時，取各組樣本各5個，無菌蒸餾水5 mL沖洗根管2次。封藥前、后均進行取樣：用消毒好的25#紙尖插入根管內停留1 min，吸出根管內液體，立即放入盛有無菌生理鹽水1 mL的Eppendorf管中，振蕩1 min，平板菌落計數法進行菌落計數，計數菌落形成單位(CFU/mL)。

2　結果

2.1DMSO和OA的MIC值DMSO對糞腸球菌的MIC值為20%，OA對糞腸球菌的MIC值為100 μg/mL。

2.2DMSO和OA聯合用藥效果微量棋盤稀釋法中，DMSO的MIC為10%，OA為1.25 μg/mL。OA與DMSO聯合時,FICI=10%/20%+1.25 μg/mL/100 μg/mL=0.512 5>0.5，OA與DMSO聯合對糞腸球菌的聯合藥敏表現為相加作用。

2.3不同時間處理前后3組感染根管內細菌量變化見表1、2、3。

表1　1 h時處理前后3組感染根管內細菌量變化

注：差值=處理前根管內菌落計數-處理后根管內菌落計數;與本組處理前比較，*P<0.05;與C組比較，#P<0.05；與B組比較，@<0.05。

表2　24 h時處理前、后3組感染根管內細菌量變化

注：差值=處理前根管內菌落計數-處理后根管內菌落計數；與本組處理前比較，*P<0.05;與C組比較，#P<0.05；與B組比較，@<0.05。

表3　7 d時處理前后3組感染根管內細菌量變化

注：差值=處理前根管內菌落計數-處理后根管內菌落計數；與本組處理前比較，*P<0.05;與C組比較，#P<0.05。

3　討論

目前用于根管消毒的藥物主要包括氫氧化鈣、氯已定等。氫氧化鈣是根管消毒常用和首選藥物，被國內外眾多學者所接受。氫氧化鈣可通過解離出大量羥基離子發揮其抗菌作用，但對于感染根管中的糞腸球菌缺乏足夠的抗菌能力[6]。此外，氫氧化鈣還具有一定的不良反應[7]。氯已定對多數細菌均具有抑菌效果，對于感染根管中的糞腸球菌的抗菌作用明顯[8]；但氯己定對根尖周的組織修復也有一定的負面影響[9]。氯己定能夠影響蛋白質合成，降低細胞增殖、細胞遷移和長期生存能力，對巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞和成骨細胞均有一定毒性。甲醛甲酚、樟腦酚也曾用于根管消毒，但因其均具有一定的細胞毒性、刺激性和半抗原性，且其細胞毒性不可逆[10]，并不適合作為根管消毒藥物，已逐漸被淘汰。由此，亟需尋找一種更加安全，且能夠更加有效地抑制根管內糞腸球菌生長的藥物，以期提高根管治療、再治療的成功率。

OA作為一種純天然藥物，能夠從1 620多種植物分離出來[11]。在我國，OA主要用于減輕急慢性肝炎患者肝臟的損傷，是臨床上治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎較為理想的藥物。隨著其藥理作用研究的不斷深入，OA在口腔疾病治療方面應用也逐步發現。研究[3]發現，OA的環糊精包和物可增強抗口腔病原菌的作用。Gnoatto等[4]發現，通過給齲齒模型大鼠喂飼含OA-β-環糊精飲食，可明顯降低齲齒的得分數。Cai等[2]認為OA能抑制突變鏈球菌的葡萄糖基轉移酶作用，減少黏性葡聚糖形成，從而抑制牙菌斑形成，有預防齲齒作用。這些研究證明OA可抑制口腔病原菌活性，達到抗菌效果。Scalon 等[5]從三萜烯酸及其衍生物的構效關系分析，通過在OA不同碳原子位點上增加羥基、羧基基團產生多種衍生物，溶于10% DMSO后測定其對多種口腔病原菌(包括糞腸球菌、變異鏈球菌、牙齦卟啉菌、粘性放線菌等)的MIC值，證明了三萜酸結構上C-3位點上的羥基和C-17位點上的羧基是OA針對口腔病原體具有抗菌活性的重要基團。因此，本研究選擇OA作為潛在的理想根管消毒藥物。

以往關于OA的抑菌實驗均未考慮DMSO對OA抑菌作用的影響，只是單純地將DMSO作為OA的賦形劑，將OA直接溶于DMSO后，測定OA的抑菌作用[5,12]。本實驗首次分別研究了DMSO和OA的抑菌效果及聯合應用的抑菌效果。藥敏研究證明：①DMSO對糞腸球菌具有抑菌性(MIC=20%)，這與以往研究結果一致[13]；②OA對糞腸球菌的MIC值為100 μg/mL，證明OA對糞腸球菌具有明顯的抑菌效果； ③DMSO作為OA的賦形劑，與其協同作用時兩種藥物濃度均有下降，聯合藥敏表現為相加作用(FICI=0.5125>0.5)，這證明DMSO可以作為OA的賦形劑，增加其在根管內的滲透作用，有效抑制根管內糞腸球菌生長。在測定OA的MIC值時，加入了5%的DMSO助溶，因其抗菌能力小，本實驗測定DMSO的MIC值為20%，均證明低濃度的DMSO對糞腸球菌不具有足夠的抑菌作用。有臨床實驗[14]證實，50%的DMSO和2.5%的雙氯芬酸聯合可明顯減輕根尖周炎疼痛、減少根管滲出，且患者對其耐受性良好，無一例出現不良反應。近年美國已批準將45.5%的DMSO作為雙氯芬酸的賦形劑，治療膝部骨關節炎[15]。選擇OA濃度時主要考慮能有效抑菌且溶于DMSO未達飽和的較高濃度。因此進一步實驗考慮用50%的DMSO與1 mg/mL的OA聯用。但二者聯合的最佳濃度還需更加嚴格的實驗證實。

糞腸球菌感染根管模型研究結果表明，A組在處理1 h后，根管內糞腸球菌數量有明顯減少，處理24 h、7d后根管內無存活的糞腸球菌。與B組相比，A組對糞腸球菌抑菌作用所需時間稍長，處理1 h后根管內細菌量略多，但處理24 h、7 d后兩組根管內均無糞腸球菌存活。與C組相比，A、B組處理1 h后細菌數量均明顯減少，這說明兩組藥物處理1 h后均能有效抑制根管內糞腸球菌生長。但若作為根管消毒藥物，1 mg/mL OA聯合50% DMSO不僅能夠滿足臨床需要，且相對于2%醋酸氯己定更加安全。

綜上所述，OA聯合DMSO對體外糞腸球菌有相加的抑菌作用，其對根管內糞腸球菌的抑菌效果明顯，24 h后與2%醋酸氯己定效果一樣，可作為再治療根管、難治性根尖周炎根管的消毒藥物。但其抗菌機制尚不完全明確，值得進一步研究。

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Inhibiting effect of combination of oleanolic acid and dimethyl sulfoxide on enterococcus faecalis

WUYou1,HUYan,WANGYao

(1OrofacialReconstructionandRegenerationLaboratory,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the inhibiting effect of oleanolic acid (OA) and dimethyl sulfoxide (DMSO) on enterococcus faecalis (E. faecalis) in drug sensitive test, and its antibacterial effect in E.faecalis infected root canals. Methods Measuring the minimal inhibitory concentrations (MICs) of OA and DMSO respectively. The microdilution checkerboard technique was applied to evaluate the antibacterial effect of OA combined with DMSO and calculate the fractional inhibitory concentration index (FICI). E.faecalis infected root canal models in extracted single-canal permanent teeth were established. Samples were randomly divided into three groups: group A which was treated with 1 mg/ml OA+50% DMSO for intracranial medication, group B with 2% chlorhexidine (CHX), and group C with deionized water (DIW). Before intracranial medication or after treatment 1 h, 24 h and 7 d, the bacteria counting was recorded and the statistical analysis was conducted.ResultsThe MIC of DMSO against E. faecalis was 20%, the MIC of OA against E. faecalis was 100 μg/ml. The FICI of DMSO and OA against E. faecalis 0.5125. Statistical analysis found that the amount of bacteria in three groups after treatment was reduced, the decrement of groups A and B showed statistical difference (allP<0.05). Group A needed a little longer action time than that of group B and significant difference was found in the amount of bacteria within 1 h (P<0.05), however, no viable E.faecalis was detected when the treatment time maintained for 24 h or 7 d in both groups (allP>0.05). ConclusionDMSO combined with OA have additive antibacterial effect against E. faecalis, and the combined application can effectively inhibit the bacteria growth in root canal.

enterococcus faecalis; oleanolic acid; dimethyl sulfoxide

四川省教育廳項目(15ZA0170/2015-00035);四川省科技廳/瀘州市科技局瀘州醫學院聯合項目(LZ-LY-53/2014tsx-013)。

吳悠 (1989-)，女，碩士，主要研究方向為牙體牙髓病學。E-mail：954365825@qq.com

簡介：王瑤(1977-)，女，副教授，博士，主要研究方向為牙體牙髓病學。E-mail：438730587@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.006

R378.1

A

1002-266X(2016)29-0017-04

2016-04-10)