缺血預處理對止血帶誘發肢體缺血再灌注損傷大鼠血漿內皮素的影響

張謝卓，閆斌，劉利國，哈斯魯，伊力哈木·托合提

(新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊 830063)

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缺血預處理對止血帶誘發肢體缺血再灌注損傷大鼠血漿內皮素的影響

張謝卓，閆斌，劉利國，哈斯魯，伊力哈木·托合提

(新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊 830063)

目的探討止血帶預處理后誘發肢體缺血再灌注損傷大鼠血漿內皮素(ET)的變化及缺血預處理對其的影響。方法 將60只體質量150～200 g健康SD大鼠(雌雄不限)編號后采用隨機數字表法將其分為對照組和實驗組，各30只。對照組未經過缺血預處理，于直接缺血2、3、4 h及恢復血流后第1、3、7、14天取血測定血漿ET水平；實驗組在大腿根部應用氣囊止血造成肢體缺血后，止血帶放松10 min形成缺血預處理過程，反復3次，于第2天分別缺血2、3、4 h后及恢復血流后第1、3、7、14天取血測定血漿ET水平。結果 兩組第1、3、7天同一處理時間血漿ET水平比較，P<0.05或<0.01；第14天兩組缺血3 h血漿ET水平比較，P<0.01。實驗組和對照組血漿ET水平在第1、3、7、14天內呈先遞增后遞減的趨勢，且在第3天或者第7天時達峰值(P均<0.05)。實驗組內第1、3、5、7天不同處理時間血漿ET水平比較，P<0.05或<0.01；對照組內第1、7天不同處理時間比較，P<0.05或<0.01。實驗組缺血2、3、4 h后不同觀察時間血漿ET水平比較，P均<0.01；對照組缺血2、3、4 h后不同觀察時間比較，P均<0.01。結論 在大鼠肢體再灌注損傷時，血漿ET水平在第3～7天達到峰值；肢體缺血再灌注初期，缺血時間越長，體內的血漿ET水平越高。給予止血帶預處理，可顯著降低大鼠體內血漿ET水平。

缺血再灌注損傷；止血帶；缺血預處理；內皮素

血漿內皮素(ET)是1998年由日本Yanagisawa發現的一種收縮血管的活性物質，局部血管損傷可引起應激反應，致血管內皮細胞和神經膠質細胞分泌和釋放ET。因ET及其受體在心血管系統中廣泛存在，所以血管損傷、血栓形成或梗死后血漿以及梗死組織局部ET水平明顯升高[1,2]。肢體缺血再灌注導致臟器損傷是多機制、多途徑介導的病理生理過程，血漿ET等炎性介質的過度釋放可能只是其中一個方面[3～5]。近年有文獻[6]從組織病理學角度報道了缺血預處理能有效防治缺血再灌注損傷，但缺血再灌注后血漿ET的水平變化情況、缺血預處理對血漿ET水平的影響以及缺血時間和血漿ET水平的關系卻不明確。2014年12月～2015年3月，本文模擬臨床上氣囊止血帶的應用方法，制作大鼠后肢缺血再灌注損傷模型，觀察止血帶誘發大鼠肢體缺血再灌注損傷時ET的變化及缺血預處理對其的影響。

1　材料與方法

1.1材料動物：健康SD大鼠60只，不分雌雄，體質量150～200 g。主要試劑及儀器：Rat ET ELisa Kit試劑盒(abcam公司；貨號：201411；批號：E-30727)；酶標儀(bio-rad,xMarkTM)；微量移液器(單道移液器、多道移液器)(大龍醫療設備有限公司)；電熱恒溫培養箱(上海精宏試驗設備有限公司；型號：DNP-9272 )；微量振蕩器(金壇市醫療儀器廠；型號：MM-2)；高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司；型號：Neofuge 15R)。

1.2分組及模型制備采用隨機數字表法將SD大鼠分為實驗組和對照組各30只。實驗組用1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)行腹腔麻醉，左后腿脫毛，在大腿根部應用特制的氣囊止血帶(長12 cm，寬2 cm)，充氣壓力為40 kPa，妥善固定10 min，造成肢體缺血后氣囊止血帶放松10 min，形成缺血再灌注預處理過程，反復3次，于次日各選10只再分別持續缺血2、3、4 h；對照組于次日各選10只分別直接持續缺血2、3、4 h。缺血后放松氣囊止血帶，恢復肢體血流。

1.3血漿ET的檢測實驗組和對照組依次于缺血2、3、4 h及恢復肢體血流(再灌注)后第1、3、7、14天時抽取血液，采用ELISA法測定大鼠血漿ET水平。

2　結果

實驗組和對照組血漿ET水平在第1、3、7、14天內呈先遞增后遞減的趨勢，且在第3天或者第7天時達峰值(P均<0.05)。實驗組內第1、3、5、7天不同處理時間比較，F值分別為4.78、75.23、15.63、5.08，P<0.05或<0.01；對照組內第1、3、5、7天不同處理時間比較，F值分別為4.76、2.64、14.81、1.24，第1、7天不同處理時間比較，P<0.05或<0.01。實驗組缺血2、3、4 h后不同觀察時間比較，F值分別為47.25、501.06、35.16，P均<0.01。對照組缺血2、3、4 h后不同觀察時間比較，F值分別為170.93、73.73、71.91，P均<0.01。詳見表1。

表1　兩組不同時間ET水平比較

注：與對照組同時間比較，*P<0.05，**P<0.01。

3　討論

氣囊止血帶廣泛應用于人工全膝關節置換術中，通過人為阻斷血流達到減少出血及改善手術野的目的，同時也提高了骨水泥與假體界面的良好粘附，但四肢手術和血管損傷時氣囊止血帶的應用可能會導致肢體缺血再灌注損傷[1]，現階段已經有大批的學者對止血帶造成的肢體缺血再灌注損傷的機制以及防治措施進行了深入的研究，因為止血帶的不恰當使用方法而造成的肢體缺血再灌注損傷的實質主要是機體產生的大量氧自由基對組織造成了損害[7]。為了防治這種損害，臨床上常采用間歇性再灌注，即應用止血帶1.5～2 h后放松止血帶10～15 min。有文獻報道，此種方法雖然可以減輕骨骼肌的缺血再灌注損傷，但骨骼肌的肌電圖在術后半年內仍可持續存在改變[8]。近年來，主要以動物實驗為主的關于肢體缺血再灌注損傷的研究較多。Murry等[9]在犬心臟缺血試驗中首先提出短暫反復的缺血及再灌注并不會疊加再灌注的損傷，而會提高組織對缺血缺氧的耐受性，這種現象被稱為是缺血預處理的保護作用。

在此次實驗研究中，無論實驗組還是對照組，血漿ET的水平均呈先遞增后遞減的趨勢，且在第3天或者第7天時達峰值。胡躍林等[6]的實驗從病理學角度出發，研究也得到了類似的結果，即不論大鼠有沒有接受缺血預處理，在肢體缺血再灌注損傷后的第3天，大鼠骨骼肌病理改變最為顯著。與此同時，研究發現實驗組血漿ET水平在第1、3、7、14天顯著低于對照組；僅在第7天實驗組中止血2 h和止血3 h的大鼠血漿ET水平高于對照組；在第14天實驗組中止血2 h的大鼠血漿ET水平低于對照組，但無統計學意義；在第14天實驗組中止血4 h的大鼠血漿ET水平高于對照組，無統計學意義。表明給予止血帶預處理，可顯著降低大鼠體內血漿ET水平，印證了Murry等[9]提出的缺血預處理的保護作用，但并不是止血帶預處理時間越長，保護作用就越強，隨著止血帶使用時間超過某個時間點，缺血預處理的保護作用就會顯著降低甚至失效，有實驗[10]證明骨骼肌的這個缺血時間節點為5 h。除此之外，我們還發現,實驗組及對照組第1天大鼠血漿ET水平隨著止血帶止血時間延長有增高趨勢，而在第3、7、14天大鼠血漿ET水平與止血帶止血時間無明顯規律。這說明在肢體缺血再灌注的初期，缺血時間越長，體內的血漿ET水平越高，而隨著缺血時間的推移，大鼠血漿ET水平逐漸趨于正常而無明顯規律。Brumback等[11]指出伴隨著缺血損傷時間的延長，骨骼肌的代謝由有氧慢慢轉變為無氧，從而減少了乳酸向丙酮酸的轉化，大量乳酸產生堆積，容易增加組織中H+的水平，造成酸中毒。缺血時間越長，骨骼肌的損傷就越顯著，因為缺氧造成的骨骼肌損傷引起ATP消耗、Na+-Ca2+交換體和Na+-K+泵功能異常及鈣離子內流，這增強了細胞蛋白酶和肌球蛋白、肌動蛋白和游離鈣的相互作用，骨骼肌纖維壞死是其最終的結果。

早在1856年，Virchow 就提出下肢深靜脈血栓形成的三大因素是血管壁損傷、血流緩慢以及血液高凝狀態。Blann等[12]對Virchow三要素重新解讀以后認為，血管內皮細胞的損傷、血小板黏附聚集和可溶性凝血因子的激活是血栓形成的新三要素，可見血管內皮細胞在血栓形成的機制中起重要作用。血漿ET可以直接反映血管內皮細胞受損情況。肢體缺血再灌注時，血管內皮細胞損傷和血管內皮功能障礙一直存在，并對細胞和實質臟器損傷產生間接的影響，通過缺血預處理后，血漿ET水平顯著降低，可以減少下肢深靜脈血栓形成的誘因，有效地預防下肢深靜脈血栓。

已有研究[13]表明預處理確實能減輕肢體缺血再灌注損傷，多年來，大量的研究也力求通過藥物或者非藥物干預來啟動內源性臟器保護功能，進而減輕組織器官的缺血再灌注損傷。在非藥物干預中，缺血預處理被認為是一種能有效地保護相關組織器官缺血再灌注損傷的方法，本實驗通過測定血漿ET水平的方法也證實了止血帶缺血預處理在一定條件下能夠顯著減輕肢體缺血再灌注損傷，降低下肢深靜脈血栓形成的概率。

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Effects of ischemic preconditioning on plasma endothelin in rats with tourniquet-induced limb ischemia reperfusion injury

ZHANGXiezhuo,YANBin,LIULiguo,HASilu,YilihamuTuoheti

(SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

Objective To observe the changes of plasma endothelin (ET) in rats with tourniquet-induced limb ischemia reperfusion injury and the effects of ischemic preconditioning on it. MethodsSixty SD rats (male and female, 150-200 g) were randomly divided into the control group and the experimental group, each group with 30 rats. Rats in the control group did not receive ischemic preconditioning and just received ischemia for 2, 3 and 4 h, and on day 1, 3, 7 and 14, we took the blood and tested ET level of rats. In the experimental group, after the ischemic preconditioning, on the second day, rats underwent ischemia for 2, 3 and 4 h, and on day 1, 3, 7 and 14, we took the blood and tested ET level of rats. ResultsSignificant difference was found in the plasma ET levels between the two groups on day 1, 3 and 7 at the same processing time,P<0.05 orP<0.01. Significant difference was found in the plasma ET level between the two groups on day 14 at ischemia 3 h,P<0.01. In the experimental group and control group, the plasma ET levels in 1, 3, 7 and 14 days first increased and then decreased, and on day 3 or day 7, it reached the peak (allP<0.05). In the experimental group, significant difference was found in the plasma ET level on day 1, 3, 5 and 7 of different processing time,P<0.05 orP<0.01; in the control group, significant difference was found in the plasma ET level on day 1and 7 of different processing time,P<0.05 orP<0.01. In the experimental group after ischemia for 2, 3 and 4 h, significant difference was found in the plasma ET level when we compared the different observation time, allP<0.01. In the control group after ischemia for 2, 3 and 4 h, significant difference was found in the plasma ET level when we compared the different observation time, allP<0.01.ConclusionsWhen the reperfusion injury was induced, the plasma ET of rats reached the peak at the third to seventh day. In the initial stage of limb ischemia reperfusion, the plasma ET level in the blood became higher as the prolonged ischemia time. Ischemic preconditioning could significantly reduce the plasma ET level.

ischemia reperfusion injury; tourniquet; ischemic preconditioning; endothelin

新疆醫科大學2013年科研創新基金項目(XJC201368)。

張謝卓(1991-)，男，碩士，主要研究方向為運動醫學。E-mail:zhangxiezhuo123@126.com

簡介：伊力哈木·托合提(1969-)，男，博士，主任醫師，主要研究方向為運動醫學及肩肘損傷。E-mail:tuohetiy@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.007

R364.1

A

1002-266X(2016)29-0021-03

2016-05-09)