艾芬地爾預(yù)處理對七氟醚致幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的保護作用及機制

劉真真，金延武，馮顥，王曉雷，趙鑫

(山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南 250100)

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艾芬地爾預(yù)處理對七氟醚致幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的保護作用及機制

劉真真，金延武，馮顥，王曉雷，趙鑫

(山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南 250100)

目的探討N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型(NR2B受體)拮抗劑艾芬地爾對七氟醚導(dǎo)致的幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的保護作用及機制。方法 出生后7 d的雄性SD大鼠隨機分為四組：對照組(Con組)給予腹腔注射雙蒸水10 mg/kg后暴露在30%氧氣下4 h；艾芬地爾組(Ifen組)給予腹腔注射艾芬地爾(10 mg/kg)后暴露在30%氧氣下4 h;七氟醚組(Sev組)腹腔注射雙蒸水后暴露在2%七氟醚4 h;七氟醚+艾芬地爾組(Sev+Ifen組)給予腹腔注射艾芬地爾后暴露在2%七氟醚下4 h。用Western blotting、免疫熒光法檢測大鼠海馬區(qū)NR2B及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表達。大鼠于出生后40 d行Morris 水迷宮和避暗實驗評估其學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果 與Con組及Sev+ Ifen組比較，Sev、Ifen組NR2B、Caspase-3、PARP、Caspase-3陽性細胞百分比均升高(P<0.05或<0.01)，Con組及Sev+ Ifen組比較，P均>0.05。在定位航行實驗中，Sev組的潛伏期于第2、3天長于Con組(P均<0.05)。空間探索實驗中，各組目標(biāo)象限的時間百分比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。避暗實驗結(jié)果表明,與Con組比較，Ifen、Sev組記憶潛伏期縮短(P均 <0.05)，Sev+ Ifen組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 預(yù)先給予艾芬地爾可減少七氟醚對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，其機制可能與抑制NR2B表達及其所誘導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。

記憶能力損傷；七氟醚；艾芬地爾；N-甲基-D-天冬氨酸受體；幼鼠

七氟醚對嚙齒類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用已被多次報道[1～3]。然而，其作用機制尚未明確。以往研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體在學(xué)習(xí)、記憶、認知等環(huán)節(jié)中起重要作用[4]。在發(fā)育期海馬神經(jīng)元中，NMDA 受體2B亞型(NR2B受體)可以傳導(dǎo)神經(jīng)元存活、死亡，以及突觸強化的信號[5]。因此，七氟醚對幼鼠產(chǎn)生的學(xué)習(xí)認知能力的損傷可能與NR2B受體有關(guān)。NR2B受體的選擇性拮抗劑艾芬地爾的神經(jīng)保護作用已被多項研究驗證，而作為神經(jīng)保護劑，艾芬地爾是否可以減輕麻醉藥所造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，這在以往的研究中尚未見報道。2013年9月～2015年7月我們探討了艾芬地爾在七氟醚所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的保護作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料動物：18只清潔級Sprague-Dawley孕鼠，飼以實驗室平衡飼料，自由進食飲水，12 h光照，12 h黑暗，室溫維持在22～25 ℃，空氣濕度維持在55%～60%，飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜。試劑及儀器：七氟醚(百特，美國)，NR2B抗體(Millipore，美國)，半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(Sigma，美國)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抗體(Sigma，美國)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(康成公司)，艾芬地爾(Sigma，美國)，麻醉氣體監(jiān)測儀(Detex- Ohmeda, Louisville, CO)，Morris水迷宮及其處理軟件(上海吉量軟件科技有限公司)，避暗實驗裝置(天津生物醫(yī)學(xué)工程研究中心)。

1.2分組及處理待幼鼠出生后7 d，選取雄性幼鼠156只，給予麻醉或假麻醉處理。行為學(xué)檢測在大鼠出生后40 d開始進行。出生后7 d的雄性SD大鼠隨機分為四組：對照組(Con組)給予腹腔注射10 mg/kg雙蒸水后暴露在30%氧氣下4 h；艾芬地爾組(Ifen組)給予腹腔注射10 mg/kg艾芬地爾后暴露在30%氧氣下4 h;七氟醚組(Sev組)腹腔注射雙蒸水后暴露在2%七氟醚4 h;七氟醚+艾芬地爾組(Sev+Ifen組)麻醉前15 min給予艾芬地爾(5 mg/mL, 2 mL/kg)腹腔注射后暴露在2%七氟醚下4 h。在麻醉過程中監(jiān)測呼吸、心率和體溫。麻醉后6 h取材。

1.3海馬區(qū)NR2B、凋亡相關(guān)蛋白的檢測 采用Western blotting法。幼鼠腹腔注射100 mg/kg 苯妥英鈉后，斷頭取腦，分離海馬組織放于液氮中待用。初步測定總蛋白濃度后，以蛋白30 μg在10%或12% SDS-PAGE膠上電泳分離，之后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下一抗(NR2B：1/1 000；Caspase-3：1/1 000，PARP：1/1 000；GAPDH：1/5 000)孵育過夜后，在辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中孵育2 h(1∶5 000)。最后用 ECL 發(fā)光試劑盒(Pierce)顯像，用灰度掃描儀檢測出相應(yīng)條帶的平均灰度值。其中，GAPDH 作為內(nèi)參。

1.4海馬區(qū)Caspase-3表達的檢測采用免疫熒光法。幼鼠在實驗處理結(jié)束后6 h，用4 ℃、4%甲醛灌注后固定過夜，然后在30%蔗糖溶液中放置48 h。用冰凍切片機切片，厚度為15 μm。用Caspase-3(1/400)室溫下孵育12 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后，避光與FICT耦連的羊抗兔二抗(1/200)室溫孵育2 h，封片后避光4 ℃保存。一抗和二抗均使用封閉液稀釋。使用 IP lab 7．0和Olympus IX70熒光顯微鏡在40×物鏡下觀察，每只動物選6張切片，每張切片取海馬CA1區(qū)4個視野，統(tǒng)計Caspase-3陽性細胞數(shù)。

1.5大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的檢測采用Morris水迷宮實驗。部分大鼠于出生后第40天行Morris水迷宮實驗。迷宮由一個直徑為180 cm，高為60 cm的圓水池構(gòu)成。池中放入一個直徑為10.3 cm的平臺，池內(nèi)水深高于平臺1.5 cm，水溫(24±1)℃。實驗過程中水池及周圍環(huán)境保持不變，供幼鼠空間定位。由攝像系統(tǒng)及水迷宮軟件記錄幼鼠游泳的時間及路徑。實驗分三個階段：訓(xùn)練階段，定位航行階段和空間探索階段，均于上午9：00～11：00 進行。水迷宮實驗自大鼠出生后第40天開始，至第47天結(jié)束。訓(xùn)練階段：將出生后第40天的大鼠分別從兩個不同象限面向池壁放入水中游90 s，每天訓(xùn)練兩次，兩次間間隔20 s，持續(xù)兩天。該階段不放置平臺。定位航行階段：檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。訓(xùn)練階段結(jié)束后，將平臺固定于某一象限，大鼠放置于平臺上20 s后分別從四個象限面向池壁放入水中。若大鼠不能在給定的時間內(nèi)(90 s)找到隱匿在水中的平臺，則將其牽引至平臺停留20 s，潛伏期記為90 s；若大鼠找到平臺，則同樣停留20 s后進入下一象限。大鼠每天行4次實驗，共持續(xù)5 d。空間探索階段：檢測大鼠的短期空間記憶能力。取走平臺，將大鼠分別從目標(biāo)象限(原平臺所在象限)的對角象限及目標(biāo)象限的左側(cè)象限放入水池，各游90 s，記錄其游泳的路徑和時間。

1.6大鼠對恐懼的記憶能力檢測 采用避暗實驗(IA)。將大鼠放入IA裝置的明箱中安靜30 s，打開明暗箱之間的門，待大鼠四足全部進入暗箱時將門關(guān)閉，給予大鼠一0.3 mA持續(xù)2 s的足部刺激。24 h后，將大鼠再次放入明箱，30 s后將門打開，記錄大鼠進入暗箱的時間[6]。

2　結(jié)果

2.1各組NR2B、Caspase-3、PARP相對表達量及Caspase-3陽性細胞百分比比較見表1。

表1　各組NR2B、Caspase-3、PARP相對表達量及Caspase-3陽性細胞百分比比較

注：與Con組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力比較在定位航行實驗中，Sev組的潛伏期于第2天和第3天長于Con組(表2)。空間探索實驗結(jié)果顯示，各組大鼠找到平臺的潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表2　定位航行實驗中各組大鼠找到平臺的潛伏期比較±s)

注：與Con組相比，*P<0.05。

2.3各組大鼠對恐懼的記憶能力Con、Ifen、Sev、Sev+ Ifen組的24 h記憶潛伏期分別為(40.13±7.88)、(20.08±7.08)、(19.45±6.64)、(35.22±6.48)s,與Con組比較，Ifen、Sev組記憶潛伏期縮短(P均<0.05)，Sev+ Ifen組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

以往研究認為，NMDA受體在學(xué)習(xí)和記憶中扮演十分重要的角色，而NR2B則對神經(jīng)元的可塑性起關(guān)鍵作用[4,7]。本研究結(jié)果顯示，麻醉藥可以導(dǎo)致幼鼠大腦海馬區(qū)NR2B表達量增加，而其所誘導(dǎo)的凋亡也相應(yīng)增加，同時伴有學(xué)習(xí)記憶能力損傷。這可能是由于NR2B不但介導(dǎo)了發(fā)育期海馬神經(jīng)元的存活和突觸強化的信號，同時也介導(dǎo)了神經(jīng)元死亡的信號，其表達量過高或過低均可誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。過量的NMDA受體的激活可導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，從而造成線粒體膜電位的降低和細胞死亡[9]。因此，NMDA受體的下調(diào)可減少這種神經(jīng)元興奮毒性。

表3　各組目標(biāo)象限的時間百分比比較±s)

注：Target=目標(biāo)象限，CW=與目標(biāo)象限順時針方向相鄰的象限；Opposite=目標(biāo)象限的對角象限，CCW=與目標(biāo)象限逆時針方向相鄰的象限。

Caspase-3在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。在凋亡的早期階段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3可裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。PARP是存在于多數(shù)真核細胞中的一個多功能蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶。它通過識別結(jié)構(gòu)損傷的DNA片段而被激活，被認為是DNA損傷的感受器。同時，PARP又是Caspase的切割底物。它在DNA損傷修復(fù)與細胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。因此，本研究通過檢測這兩種蛋白的表達來評估神經(jīng)元的凋亡。結(jié)果顯示，單獨使用艾芬地爾和七氟醚均可導(dǎo)致Caspase-3、PARP表達量的升高。而預(yù)先使用艾芬地爾則可減少七氟醚所致的神經(jīng)元的凋亡。這與NR2B表達量的變化是一致的。

艾芬地爾作為NR2B受體的選擇性拮抗劑，在很多體內(nèi)體外的神經(jīng)病理性模型和腦損傷模型中起神經(jīng)保護作用[10,11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，預(yù)先使用艾芬地爾不僅可減少吸入麻醉藥誘導(dǎo)的凋亡，而且還減輕了其所致的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。但單獨給予艾芬地爾時，NR2B及凋亡相關(guān)蛋白的表達量是增加的。也有研究表明，訓(xùn)練前預(yù)先給予艾芬地爾可以導(dǎo)致幼鼠認知功能的損傷。其實這并不矛盾，在正常情況下，艾芬地爾可以和NR2B受體結(jié)合，并使NR2B受體反應(yīng)性增多，而此時，增多的NR2B受體并沒有正常的活性和功能。這樣就影響了正常水平的NR2B受體對神經(jīng)元的促存活作用，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。而當(dāng)大腦受到一定程度的損傷或刺激時，大量的谷氨酸釋放到突觸間隙，NR2B 受體過度激活，細胞內(nèi)Ca2+的瞬間變化會觸發(fā)興奮性毒性，導(dǎo)致蛋白酶、核酸內(nèi)切酶的激活，促進一氧化氮和自由基的產(chǎn)生，引起線粒體膜滲透性改變，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷乃至死亡[12,13]。作為NR2B受體的拮抗劑，艾芬地爾可以選擇性地與NR2B受體相結(jié)合，從而減少谷氨酸的興奮毒性作用，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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趙鑫(E-mail：lujnzx@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.009

R749.1

A

1002-266X(2016)29-0028-03

2016-05-06)