腹腔注射西地那非對(duì)噪聲性聾豚鼠聽(tīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

梁媛,張淑君，馬桂琴，尹桂茹，陸鴻略，劉春麗

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 河北承德 067000)

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腹腔注射西地那非對(duì)噪聲性聾豚鼠聽(tīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

梁媛,張淑君，馬桂琴，尹桂茹，陸鴻略，劉春麗

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 河北承德 067000)

目的探討5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑對(duì)噪聲性聾豚鼠聽(tīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、噪聲暴露組和治療組，每組15只。治療組及噪聲暴露組豚鼠在白噪聲暴露1周后分別腹腔注射西地那非10 mg/(kg·d)及生理鹽水4 mL/(kg·d)，連續(xù)給藥4周。分別測(cè)試噪聲暴露前1天、噪聲暴露后1、2及4周Ⅰ波潛伏期和聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值,并通過(guò)掃描電鏡觀察噪聲暴露后4周豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)變化。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，噪聲暴露組和治療組豚鼠體質(zhì)量在噪聲暴露后,給藥1、2、4周后均降低(P均<0.05)；噪聲暴露組比治療組給藥1、2、4周后體質(zhì)量降低，兩組比較，P均<0.05。治療組豚鼠噪聲暴露后，給藥1、2、4周后較噪聲暴露前其Ⅰ波潛伏期及ABR閾值均呈下降趨勢(shì)，噪聲暴露組豚鼠給藥1周后較噪聲暴露前和噪聲暴露后呈升高趨勢(shì)，但在給藥2、4周后較給藥1周后呈明顯下降趨勢(shì)；與對(duì)照組比較，噪聲暴露組及治療組在噪聲暴露后的各時(shí)間ABR閾值升高，Ⅰ波潛伏期延長(zhǎng)(P均<0.05)；給藥后各時(shí)間，治療組與噪聲暴露組比較，P均<0.05。掃描電鏡顯示，噪聲暴露組豚鼠耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞均出現(xiàn)聽(tīng)毛紊亂、融合及缺失；而治療組耳蝸病變較輕，聽(tīng)毛僅有輕微倒伏、融合現(xiàn)象。結(jié)論 腹腔注射PDE5抑制劑西地那非能夠減輕噪聲性聾豚鼠的聽(tīng)功能損害，可能與其降低ABR閾值，縮短噪聲引起的Ⅰ波潛伏期有關(guān)。

噪聲性耳聾；5-磷酸二酯酶抑制劑；耳蝸；毛細(xì)胞；聽(tīng)功能；豚鼠

噪聲性耳聾(NHIL)是由噪聲引起的一種感音神經(jīng)性聾，噪聲污染已被認(rèn)為是世界七大公害之首。雖然許多擴(kuò)血管藥物因其能提高內(nèi)耳血流量和改善血管痙攣而被用于噪聲性聽(tīng)力損傷的治療[1]，但迄今尚無(wú)理想的治療方法。5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑通過(guò)增強(qiáng)NO/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)途徑，升高cGMP水平，從而起到擴(kuò)張血管平滑肌的作用。在臨床上，它被廣泛應(yīng)用于治療陰莖勃起功能障礙，同時(shí)，人們還研究并探討了其對(duì)心血管系統(tǒng)、肺功能、呼吸系統(tǒng)、視覺(jué)、鎮(zhèn)痛方面的影響，但在聽(tīng)覺(jué)損傷方面尚無(wú)系統(tǒng)的報(bào)道。臨床診療中發(fā)現(xiàn)多位勃起功能障礙患者服用PDE5抑制劑后原下降之聽(tīng)力有所改善。Jaumann等[2]首次在耳蝸中發(fā)現(xiàn)PDE5蛋白高表達(dá)，并與環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷依賴(lài)性蛋白激酶1(Prkg1)編碼基因部分共定位。這為PDE5抑制劑在聽(tīng)覺(jué)損傷治療方面提供了潛在可能。2014年11月～2015年5月，本實(shí)驗(yàn)擬在對(duì)噪聲暴露1周后的豚鼠腹腔內(nèi)注射一定劑量的西地那非,通過(guò)觀察豚鼠致聾后ABR及潛伏期的變化，探討PDE5抑制劑是否能減輕噪聲對(duì)豚鼠耳蝸聽(tīng)功能的損害。

1　材料與方法

1.1材料 耳廓反射靈敏的健康雜色雄性豚鼠45只(承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量250～305 g。主要試劑和儀器：枸櫞酸西地那非(美國(guó)輝瑞,批號(hào):C070652)，Keyponit型4通道聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位儀(Dantec，丹麥),掃描電子顯微鏡(S-3500N SEM，日立，日本)，解剖顯微鏡(Mnler 顯微鏡，德國(guó))。

1.2動(dòng)物分組及處理按隨機(jī)數(shù)字表法將豚鼠分為正常對(duì)照組、噪聲暴露組和治療組，每組15只。各組豚鼠在經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉及無(wú)菌條件下于顱頂部雙側(cè)皮層聽(tīng)區(qū)硬膜外手術(shù)埋植不銹鋼絲慢性電極(記錄電極),牙科水泥固定,穩(wěn)定1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。噪聲暴露組和治療組豚鼠暴露于噪聲1周。將豚鼠置于自制小籠(20 cm×20 cm×20 cm)內(nèi)，每籠1只，放入暴露艙(26 m3)；由信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生20～2 000 Hz的白噪聲，經(jīng)GY型400 W擴(kuò)音器放大,并由揚(yáng)聲器組向暴露艙播放；暴露時(shí)用B&K 2107型頻率分析儀連續(xù)監(jiān)測(cè)，暴露聲壓級(jí)(A計(jì)權(quán))為110 dB，動(dòng)物暴露范圍內(nèi)聲場(chǎng)不均勻度為±1 dB。豚鼠每日暴露1次,每次2 h,連續(xù)暴露1周。對(duì)照組豚鼠安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，未給予噪聲暴露。豚鼠噪聲暴露結(jié)束后即開(kāi)始給藥，噪聲暴露組腹腔注射生理鹽水(4 mL/kg,每日1次)，治療組豚鼠腹腔注射西地那非10 mg/kg(將西地那非用生理鹽水稀釋?zhuān)? mL/kg，1次/d)，連續(xù)給藥4周。

1.3Ⅰ波潛伏期及聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試動(dòng)物保持清醒狀態(tài),半限制于測(cè)試籠中,置于隔聲電屏蔽室內(nèi)。分別于噪聲暴露前1 d，藥物干預(yù)后第1、2、4周進(jìn)行Ⅰ波潛伏期及ABR測(cè)試。對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)試。記錄電極置于顱頂部，參考電極和接地電極分別置于同側(cè)和對(duì)側(cè)乳突部。濾波帶通30～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時(shí)間15 ms。采用0.1 ms方波脈沖刺激聲，頻率20 Hz，記錄Ⅰ波潛伏期，即80 dB HL下ABR Ⅰ波出現(xiàn)時(shí)的時(shí)間，并以Ⅲ波剛剛出現(xiàn)時(shí)的刺激強(qiáng)度作為ABR閾值。

1.4耳蝸螺旋器細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察從3組中任意選取5只豚鼠,取其耳蝸?zhàn)鳛閽呙桦婄R觀察對(duì)象。豚鼠完成最后給藥及ABR測(cè)試后(噪聲暴露后4周)斷頭處死,取出其中的顳骨，在解剖顯微鏡下打開(kāi)聽(tīng)泡，蝸尖鉆孔及鐙骨脫位，2.5%戊二醛前固定，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中漂洗3次，每次10 min，1%鋨酸固定1 h,再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗、乙醇梯度脫水和干燥，金屬鍍膜，在掃描電鏡下觀察耳蝸螺旋器細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

2　結(jié)果

2.13組豚鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量比較實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，豚鼠無(wú)死亡，未發(fā)現(xiàn)中耳感染、行走不穩(wěn)等跡象。給藥后均未出現(xiàn)明顯的藥物不良反應(yīng)。3組不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量比較見(jiàn)表1。

表1　3組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與噪聲暴露組比較，bP<0.05。

2.23組不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ波潛伏期比較 見(jiàn)表2。

2.33組不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值比較見(jiàn)表3。

表2　3組不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ波潛伏期比較

注：與噪聲暴露前比較，aP<0.05；與噪聲暴露后比較，bP<0.05；與噪聲暴露組比較，cP<0.05；與對(duì)照組比較，dP<0.05。

表3　3組不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值比較

注：與噪聲暴露前比較，aP<0.05；與噪聲暴露后比較，bP<0.05；與噪聲暴露組比較，cP<0.05；與對(duì)照組比較，dP<0.05。

2.43組耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)的改變 對(duì)照組豚鼠耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，界限清楚。噪聲暴露組內(nèi)毛細(xì)胞損傷較輕，3排外毛細(xì)胞損傷明顯，主要表現(xiàn)為聽(tīng)毛紊亂、融合及缺失。治療組耳蝸損傷相對(duì)較輕，內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，與對(duì)照組相比差異不大，外毛細(xì)胞聽(tīng)毛僅有輕微傾倒融合現(xiàn)象。

3　討論

噪聲是危害人類(lèi)身體健康的社會(huì)公害，其對(duì)聽(tīng)覺(jué)器官損害是多方面的，主要包括耳蝸和中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)兩個(gè)方面。噪聲性聽(tīng)力損傷是一類(lèi)常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降，其發(fā)病機(jī)制目前主要有如下學(xué)說(shuō)：機(jī)械學(xué)說(shuō)、血管學(xué)說(shuō)、鈣離子紊亂學(xué)說(shuō)、NO/cGMP學(xué)說(shuō)等[3]。

研究表明，NO/cGMP途徑存在于內(nèi)耳中并參與耳蝸的各項(xiàng)功能活動(dòng)，它對(duì)耳蝸生理功能具有調(diào)節(jié)作用，特別是在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)及改善微循環(huán)方面。環(huán)繞耳蝸血管紋毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞是平滑肌樣細(xì)胞，通過(guò)它的收縮功能來(lái)調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的滲透性和血管直徑。研究發(fā)現(xiàn)，外源性NO可松弛處于收縮狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞中存在cGMP的靶酶-Prkg，故推測(cè)NO通過(guò)cGMP發(fā)揮作用。所以NO/cGMP通路可能是調(diào)節(jié)耳蝸血供的主要途徑[4]。

耳蝸傳入神經(jīng)主要接受由內(nèi)毛細(xì)胞傳遞的信息。當(dāng)內(nèi)毛細(xì)胞向突觸間隙釋放的神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸與突觸后膜上的谷氨酸受體結(jié)合后，產(chǎn)生的突觸后電位使胞膜去極化，從而形成神經(jīng)沖動(dòng)。在這個(gè)過(guò)程中可能有NO/cGMP通路的參與。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，NO/cGMP通路能夠調(diào)節(jié)聽(tīng)覺(jué)通路腦干部分神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，其中NO被認(rèn)為是調(diào)節(jié)谷氨酸受體活性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物。這一負(fù)反饋調(diào)節(jié)過(guò)程的意義在于可以減弱谷氨酸神經(jīng)毒性作用對(duì)神經(jīng)的損害。

近年研究表明，哺乳動(dòng)物的支持細(xì)胞是潛在的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)體液因子的靶細(xì)胞，豚鼠柱狀細(xì)胞的游離Ca2+濃度變化是由嘌呤和NO-cGMP-蛋白激酶G通路調(diào)節(jié)的[5]。聽(tīng)覺(jué)靈敏度是受支持細(xì)胞的位移來(lái)調(diào)控，在高強(qiáng)度噪聲暴露時(shí)，支持細(xì)胞可保護(hù)耳蝸功能[6]；且認(rèn)為支持細(xì)胞間、支持細(xì)胞與外毛細(xì)胞間的縫隙連接對(duì)細(xì)胞生理的協(xié)調(diào)和小離子的交換具有重要意義[6]。耳蝸中的縫隙連接蛋白主要為Cx26和Cx30，存在于耳蝸內(nèi)的支持細(xì)胞和連接組織細(xì)胞中，cGMP、三磷酸肌醇、ATP和cAMP等陰離子參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞、營(yíng)養(yǎng)、能量代謝是通過(guò)連接蛋白G26實(shí)現(xiàn)的[7]。從而推測(cè)NO-cGMP通路通過(guò)調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的功能狀態(tài)，進(jìn)而影響基底膜及蓋膜的緊張度，間接影響外毛細(xì)胞的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著病程的延長(zhǎng)，噪聲暴露組于給藥1周后Ⅰ波潛伏期達(dá)2.31 ms，雖然于給藥第2周后有所降低，但仍明顯高于對(duì)照組。而治療組豚鼠Ⅰ波潛伏期延長(zhǎng)的程度明顯低于噪聲暴露組,在給藥4周后,其Ⅰ波潛伏期也明顯短于噪聲暴露組。兩組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)病變部位可能在耳蝸底回。因?yàn)槎搪曇鸬穆?tīng)性腦干反應(yīng)首先來(lái)自耳蝸底回，短聲是一種寬頻帶噪聲，含有低頻成分，當(dāng)耳蝸底回受損害時(shí)，Ⅰ波主要是由短聲的低頻刺激頂回毛細(xì)胞所引出，由于行波延遲，致使Ⅰ波潛伏期延長(zhǎng)。這與耳蝸鋪片中底回特別是鉤端的毛細(xì)胞損失嚴(yán)重相一致。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)豚鼠經(jīng)穩(wěn)態(tài)白噪聲連續(xù)暴露后,普遍有ABR閾值上移,在給藥2周后,噪聲暴露組平均閾值仍然高達(dá)50 dB以上，可以認(rèn)為該組動(dòng)物已有永久性閾移。但治療組豚鼠，其ABR閾移的幅度明顯低于噪聲暴露組,在給藥4周后,其ABR閾值已基本接近噪聲暴露前水平,該組動(dòng)物所形成的閾移屬于暫時(shí)性閾移。

PDE5抑制劑因其能增強(qiáng)NO/cGMP途徑，升高cGMP水平，已經(jīng)在性功能障礙、心血管系統(tǒng)、肺動(dòng)脈、呼吸系統(tǒng)、視覺(jué)、鎮(zhèn)痛等方面取得肯定療效，但對(duì)聽(tīng)覺(jué)損傷的保護(hù)作用尚無(wú)系統(tǒng)報(bào)道。西地那非為一種選擇性PDE5抑制劑，能夠增加eNO的釋放，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸毛細(xì)胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1-PARP(ADP聚合酶)信號(hào)肽[2]。PARP1是廣泛表達(dá)的DNA缺口末端的傳感元件，并以NAD+為底物，催化ADP多聚核糖到受體蛋白，經(jīng)DNA斷裂并激活PARP，這有利于轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和DNA堿基切除修復(fù)[9]。但是，NO的毒副作用又與DNA損傷、PARP過(guò)度活化及伴隨的因NAD+或ATP耗盡引起的細(xì)胞壞死有關(guān)[10]。因?yàn)镻ARP可能直接激活cGMP[11]，所以PDE5抑制劑能在增加cGMP信號(hào)肽的保護(hù)作用同時(shí)，而不提高高濃度NO的潛在破壞效應(yīng)。因此推測(cè)PDE5抑制劑縮短Ⅰ波潛伏期可能是通過(guò)PDE5-cGMP-Prkg1途徑調(diào)節(jié)的。

總之，腹腔內(nèi)注射一定劑量的PDE5抑制劑西地那非,可以降低噪聲性聾引起的ABR閾值升高，縮短噪聲引起的Ⅰ波潛伏期延長(zhǎng)。由此推論出PDE5抑制劑對(duì)噪聲所致聽(tīng)功能損傷有一定的逆轉(zhuǎn)作用。

[1] 孫建軍,刁明芳.急性聽(tīng)力損失的診斷與治療[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,42(11):877-880.

[2] Jaumann M, Dettling J, Gubelt M, et al. cGMP-Prkg1 signaling and Pde5 inhibition shelter cochlear hair cells and hearing function[J]. Nat Med, 2012,18(2):252-258.

[3] 賴(lài)丹,黎萬(wàn)榮,李興啟.一氧化氮對(duì)過(guò)氧化氫所致聽(tīng)力損失的保護(hù)作用[J].生理學(xué)報(bào),2004,56(2):237-242.

[4] Matsunobu T, Schacht J. Nitric oxide/cyclic GMP pathway attenuates ATP-evoked intracellular calcium increase in supporting cells of the guinea pig cochlea[J]. J Comp Neurol, 2000,423(3):452-461.

[5] Chung JW， Schacht J. ATP and nitric oxide modulate intracellular calcium in isolated pillar cells of the guinea pig cochlea[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2001,2(4):399-407.

[6] Flock A, Flock B, Fridberger A, et al. Supporting cells contribute to control of hearing sensitivity[J]. J Neurosci, 1999,19(11):4498-4507.

[7] 張璞，林曦，曲雁.Connexin 蛋白與耳聾[J].中華耳科學(xué)雜志,2013,11(1):156-159.

[8] Wayman C, Hornby S, Burden A, et al. Sildenafil increases erection hardness by improved penile oxygenation in the anaesthetized dog [J]. J Sex Med, 2006,3(Suppl 3):226.

張淑君(E-mail：liangyuan12388@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.010

R764.43

A

1002-266X(2016)29-0031-03

2015-07-14)