IL-10單核苷酸多態性與顱內動脈瘤破裂的關系

邵得明,于向東,邱虹,王玉玨 ,陳廣,楊國科

(1遷安市人民醫院，河北遷安 064400；2開灤總醫院)

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IL-10單核苷酸多態性與顱內動脈瘤破裂的關系

邵得明1,于向東2,邱虹2,王玉玨2,陳廣2,楊國科1

(1遷安市人民醫院，河北遷安 064400；2開灤總醫院)

目的分析IL-10基因啟動子區-819 C/T和-592 C/A單核苷酸多態性(SNP)與顱內動脈瘤(IAs)破裂的關系。方法 267例IAs患者根據IAs是否破裂分為破裂組與未破裂組，用PCR法檢測IL-10基因啟動子區兩個SNP位點，-819 C/T和-592 C/A的基因型和等位基因頻率。結果破裂組IL-10基因啟動子區-819 C/T位點CC、CT+TT基因型分別為51、113例，C、T等位基因分別為132、196頻次；未破裂組分別為17、86例，56、150頻次；兩組比較，P均<0.01。破裂組IL-10基因啟動子區-592C/A位點的CC基因型、CA+AA基因型分別為66、98例，C、A等位基因頻率分別為154、174頻次；未破裂組分別為23、80例，76、130頻次；兩組比較，P均<0.01。-819位點CT+TT基因型及-592位點CA+AA基因型IAs患者更易出現破裂(OR分別為2.283、2343,95%CI分別為1.233～4.229、1.339～40.97)。結論 IL-10 SNP可能與IAs的破裂相關。-819C/T野生型純合子CT+TT基因型及-592C/A野生型純合子CA+AA基因型患者IAs破裂的風險更高。

顱內動脈瘤；白細胞介素10；多態性，單核苷酸；聚合酶鏈反應

顱內動脈瘤(IAs)是嚴重危害人類健康的腦血管疾病，首次破裂致蛛網膜下腔出血(SAH)后致殘率和致死率均可高達1/3[1]。IAs是由多種環境因素和多個基因共同作用而引發的多基因疾病。關于IAs發病及破裂機制的遺傳學研究越來越成為熱點。IL-10主要由Th2細胞產生，具有抗炎和免疫抑制雙重作用。本研究探討了IL-10 SNP與IAs破裂的關系。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2011年3月～2015年2月在唐山市開灤總醫院和河北省遷安市人民醫院神經外科住院治療的IAs患者267例，均通過全腦數字減影血管造影或手術確診，排除合并動靜脈畸形、Moyamoya病、創傷性及真菌性動脈瘤，患者均為唐山地區漢族人，無卒中病史；無動脈瘤家族史及SAH家族史；彼此無親緣關系。按IAs是否破裂分為破裂組和未破裂組，其中破裂組164例，男78例、女86例，年齡20～79(53.5±11.4)歲，吸煙者31例、糖尿病24例、高血壓97例；未破裂組103例，男50例、女53例，年齡24～82(52.4±11.8)歲。吸煙者22例、糖尿病18例、高血壓65例。瘤體部位分別位于眼動脈、基底動脈、后交通動脈、前交通動脈、頸內動脈、大腦前動脈、大腦中動脈、大腦后動脈等。破裂引起的SAH經頭顱CT或腰椎穿刺證實，破裂組均為初發SAH。兩組基線資料有可比性。

1.2IL-10 SNP的檢測采用PCR法。擴增目的片段：采集研究對象靜脈血2 mL，收集于乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝管中，-20 ℃冰箱中凍存待檢。采用傳統酚-氯仿抽提乙醇沉淀法提取白細胞中DNA并作為PCR模板。-819C/T擴增:上游引物序列：5′-GGCACTGGTGTACCCTTGTA-3′；下游引物序列：5′-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT-3′。反應條件：①預變性95 ℃，5 min；②變性94 ℃,40 s；③退火63 ℃,30 s；④延伸72 ℃,1 min；②～④共進行40個循環；⑤延伸72 ℃，5 min。-592C/A擴增:上游引物序列：5′-GGTAAAGGAGCCTGGAACACATC-3′；下游引物序列：5′-GCCCTTCCATTTTACTTTCCAGAGA-3′。反應條件：①預變性95 ℃，5 min；②變性94 ℃,40 s；③退火61.8 ℃,30 s；④延伸72 ℃,1 min；②～④共進行40個循環；⑤延伸72 ℃，5 min。PCR產物檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性擴增的目的條帶，樣本純化后由國家人類基因組北方研究中心上機測序，按ABI 3730XL標準操作程序進行。

1.3統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。計算不同基因型IAs患者發生破裂的OR值及其95%CI。P<0．05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1IL-10 SNP標本均成功擴增出目的片段，-819C/T位點經PCR擴增得到402 bp片段，電泳結果顯示擴增出的條帶單一，特異性良好。產物經測序發現，3種基因型：野生純合子CC基因型、雜合子CT基因型、突變純合子TT基因型。-592C/A擴增得到412 bp的片段，電泳結果顯示擴增出的條帶單一，特異性良好。PCR產物經測序發現3種基因型：野生純合子CC基因型、雜合子CA基因型、突變純合子AA基因型。

2.2IL-10啟動子區-819C/T和-592C/A位點不同多態性分布的IAs患者發生破裂的風險見表1、2。以-819C/T野生型純合子CC基因型為對照，分析各基因型IAs患者發生破裂的風險，結果發現CT+TT基因型增加了IAs發生破裂的風險性(OR=2.283，95%CI1.233～4.229)；以-592C/A野生型純合子CC基因型為對照，發現CA+AA基因型IAs患者發生破裂的風險更高(OR=2.343，95%CI1.339～4.097)；破裂組與未破裂組相比，-819位點T等位基因(OR=1.804，95%CI1.236～2.633)、-592位點A等位基因頻率更高(OR=1.514，95%CI1.060～2.162)。

表1　兩組IL-10 -819C/T位點多態性分布

注：與未破裂組比較，*P<0.01。

表2　兩組IL-10-592C/A位點多態性分布

注：與未破裂組比較，*P<0.01。

3　討論

IL-10是體內最重要的抑炎性細胞因子，可由Th2細胞、CD4+和CD8+T細胞、B細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞等分泌，其中以Th2細胞、CD8+T細胞及巨噬細胞為主[2]。IL-10既能抑制Th1細胞合成分泌IFN-γ等促炎性細胞因子、下調細胞免疫反應，又可以通過下調主要組織相容性復合體Ⅱ類抗原與CD54、CD80和CD68等協同刺激分子的表達，減弱其抗原呈遞能力，在免疫反應的調節中發揮關鍵作用。IL-10的產生由遺傳決定，特別是基因啟動子區對IL-10產生起重要作用。國外有研究表明，IL-10基因啟動子區域-819C/T、-592C/A位點的SNP與IL-10基因的轉錄活性及血清中IL-10的水平有關[3]。李貞娟等[4]研究結果亦顯示，IL-10 啟動子區SNP影響IL-10 表達。人IL-10基因定位于1號染色體的q31-32，其基因組包括5個外顯子和4個內含子，并具有NF-κB和AP-1的結合位點。IL-10基因轉錄起始部位上游處有3個SNP位點，即-1 082G/A、-819C/T、-592C/A。其中有些SNP 可能與疾病有關，尋找特定的SNP是發現相關疾病易感基因的非常重要途徑[5]。IL-10 SNP與疾病的易感性、嚴重程度等有相關關系[6,7]。Lee等[8]曾報道IL-10 SNP與韓國人群胃癌的發病關系。

IAs發病和破裂的具體機制尚不明確。近年研究發現,IAs組織中存在白細胞和巨噬細胞浸潤，同時存在大量免疫和炎癥相關基因的異常表達，表明免疫和炎癥反應在IAs發生和發展過程中起重要作用[9]。有國外學者觀察到IL-6和TNF-α等炎性細胞因子在IAs中的致病作用[10,11]。Sun等[12]曾報道IL-6 -572G/C SNP與中國漢族人IAs的相關關系。本研究結果顯示，IL-10 -819 C/T位點CC基因型與CT+TT基因型比較，后者增加了IAs發生破裂的風險性；-592C/A位點CA+AA基因型較CC基因型患者IAs破裂的風險更高；破裂組與未破裂組相比，-819位點T等位基因、-592位點A等位基因頻率更高。提示IL-10 SNP可能與IAs的進展及破裂相關。其可能機制為IL-10-819T等位基因及-592A等位基因會直接影響轉錄因子EtsY與該序列DNA結合，使之不能結合EtsY從而抑制轉錄，因此IL-10的水平明顯下降。IL-10的減少則不能發揮其抑制MMP[13]和TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子生成、減輕炎癥反應的作用，TNF-α、IL-6可促進成纖維細胞等對MMP的釋放[14]，炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等相互促進，啟動和加重了血管壁的炎癥反應，它們的過度分泌和表達可破壞血管壁內皮以及平滑肌的結構與功能，通過介導炎癥反應的多種炎細胞分泌的蛋白酶類直接導致膠原蛋白和彈性蛋白降解及血管重構，從而導致管壁變薄、脆性增加、抗張力性能減弱，在血流動力學改變等協同作用下，進一步誘導動脈瘤的發生發展，直至破裂而發生SAH。反之，-819位點C等位基因和-592位點C等位基因攜帶者IL-10基因表達增加，血漿水平相對較高，抗炎效應顯著，血管壁保護作用較強，從而降低了IAs患者的破裂風險。

本研究存在一定的選擇偏倚，且未能檢測患者體內IL-10濃度，但在設計與質量控制中調整了年齡、性別和高危人群種類等混雜因素，減少了這些因素對結果的影響。本結果為IL-10的生物學作用研究提供了一個新的思路，有助于我們對IAs破裂機制進行深入研究以及對未破裂IAs患者進行早期基因干預，但尚需在不同族群、大樣本、前瞻性研究中得到驗證。

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