細極鏈格孢發育及其侵染鐵皮石斛的顯微觀察

汪正紅，李　祥，楊文超，丁　麗，陳俊梅，薛春麗，潘正瓊，孔　瓊，楊申宣

（1.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199；2.蒙自市農業技術推廣中心，云南蒙自 661199）

細極鏈格孢發育及其侵染鐵皮石斛的顯微觀察

汪正紅1，李祥1，楊文超1，丁麗1，陳俊梅1，薛春麗1，潘正瓊2，孔瓊1，楊申宣1

（1.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199；2.蒙自市農業技術推廣中心，云南蒙自 661199）

細極鏈格孢是引起鐵皮石斛黑斑病的病原菌。文章觀察病原菌的生長發育及其侵染鐵皮石斛葉片過程。結果表明：細極鏈格孢發育速度較快，通過傷口侵染寄主植物，并能在葉片上萌發、生長和定殖，從而引起病害。分生孢子于12h時萌發，24h形成菌絲，第3-4d產生孢子梗，并在其上著生鏈狀分生孢子，第5-6d時產生大量菌絲和分生孢子，并布滿了整個傷口組織。

細極鏈格孢；發育；鐵皮石斛；侵染

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，在抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和治療白內障等方面具有很好療效.［1］由于野生資源稀少不能滿足市場需求，人們開始大規模種植，隨著種植面積擴大和年限的延長，鐵皮石斛上各種病害日益加重.據田間調查發現疫病、炭疽病、黑斑病、莖基腐病等為鐵皮石斛的主要病害，［2］其中由細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）引起的黑斑病在云南屏邊、文山、西雙版納、瀘西等鐵皮石斛種植基地尤為嚴重，發病率高達30-50%.細極鏈格孢不但能通過病原孢子或菌絲的機械壓力侵入寄主，還會在繁殖過程分泌產生次生代謝產物（毒素）對寄主植物產生危害，而這些代謝產物還會殘留與植物體內，人類食用后具有誘變和致癌的作用.［3］因此該病原菌不僅影響鐵皮石斛的生長發育，還嚴重影響鐵皮石斛品質.

鐵皮石斛黑斑病的研究文獻較少，主要側重于病原菌鑒定、生物學特性及室內化學藥劑篩選等方面，［4-8］而關于病原菌是如何侵染鐵皮石斛葉片的文獻較少.因此本文選取鐵皮石斛葉片和細極鏈格孢菌種為試驗材料，觀察其生長發育和細極鏈格孢侵染鐵皮石斛葉片的過程，為進一步研究病原菌的致病機制和病害防治提供理論依據.

1　材料與方法

1.1供試材料

選取鐵皮石斛黑斑病病原菌—細極鏈格孢為供試菌種；移栽馴化3個月的鐵皮石斛組培苗葉片為接種材料；所用培養基為清水瓊脂培養基和PCA（胡蘿卜200g、馬鈴薯200g、瓊脂17g、蒸餾水1000ml）.

1.2方法

1.2.1菌種培養及孢子懸浮液制作

將菌種接于PCA平板培養基上，置于27±1℃人工培養箱中培養10d，光照強度為60%，光周期為L：D=12：12，并用無菌水制成1×106個/ml孢子懸浮液.

1.2.2細極鏈格孢生長發育情況觀察

取1mL孢子懸浮液涂抹于清水瓊脂培養基于1.2.1中培養條件下培養，分別于不同的培養時間下取樣進行顯微觀察.即將小段透明膠帶貼于接種了孢子懸浮液的清水瓊脂培養基上，隨后將膠帶取下置于載玻片上滴一滴蒸餾水，加蓋玻片在顯微鏡下觀察.

1.2.3細極鏈格孢菌對鐵皮石斛葉片的侵染過程

選取健康長勢一致的鐵皮石斛葉片作為實驗材料，采用針刺法接種，每片葉片接種10ul孢子懸浮液（濃度為1×106個/ml），隨后將接種后的植株置于人工氣候箱內進行培養，并于不同時間下取樣染色、脫色后進行觀察。培養溫度為27±1℃，相對濕度99%，光照強度為60%，光周期為L：D=12：12.

具體方法為：將取樣后的葉片放入染色液中煮沸5min，然后置于脫色液中脫色12h，以蒸餾水做浮載劑進行顯微觀察.染色液配方：10ml甘油、10ml乳酸、10g苯酚、10mg甲基藍，幾種混合后溶于10ml蒸餾水中，加熱溶解.脫色液配方：0.15%三氯乙酸溶解于體積比為3：1乙醇和氯仿混合溶液中.［4］

2　結果與分析

2.1細極鏈格孢發育情況

在不同培養時間下，細極鏈格孢生長發育速度較快，具體情況見圖1.孢子在12h開始萌發（圖1-B），形成單個或多個芽管；隨后芽管向各方向生長，形成菌絲（圖1-C）；第4-5d時，菌絲生長到后期分化形成顏色較深且粗壯的分生孢子梗，且著生有鏈狀分生孢子（如圖1-DE）.之后菌絲老化加重，顏色不斷加深，繁殖能力下降（圖1-F）.

圖1　細極鏈格孢菌在清水瓊脂培養基上的生長情況

2.2細極鏈格孢菌對鐵皮石斛的侵染

2.2.1葉片侵染癥狀觀察

前期實驗發現細極鏈格孢在無傷口的鐵皮石斛葉片上發病時間較長，因此本文采用針刺法進行接種.在有傷口的情況下，鐵皮石斛葉片被細極鏈格孢侵染后的發病過程（見圖2），對照不發病.并且該菌的發病病程較長，于接種第4d時葉片呈現可見的淺黃色病斑，隨后病斑逐漸擴大，第7d時的葉片出現黃褐色病斑（圖2-B）；第12d時發病癥狀更加明顯，黑色圓形病斑，同時病部組織破裂并出現凹陷，（圖2-C）；第22d時，病斑周圍葉片變黃，隨后整片葉片變黃脫落（圖2-D）.

圖2　細極鏈格孢侵染鐵皮石斛的發病情況

2.2.2細極鏈格孢菌對鐵皮石斛侵染的顯微觀察

將細極鏈格孢接種于鐵皮石斛葉片，12h后在葉片可觀察到剛萌發的分生孢子（圖3-B），第2d時萌發后的菌絲開始向各個方向生長，隨后形成茂密的菌絲（圖3-C）；第4d時，組織表面可觀察到很多菌絲，并侵入到寄主植物組織內部，且菌絲分化形成大量的產孢梗（圖3-D）；第5d時在菌絲內部觀察有大量的分生孢子產生（圖3-E）；第6d時，傷口處布滿大量菌絲和分生孢子，且可見癥狀較為明顯（圖3-F），這與觀察到的可見癥狀相吻合.同時細極鏈格孢在鐵皮石斛葉片上的侵染過程也與該菌的生長發育具有一致性.

圖3　細極鏈格孢在鐵皮石斛葉片定殖后的顯微情況

3　小結與討論

細極鏈格孢是一種植物病原真菌，具有廣泛的寄主范圍，給農業生產帶來巨大損失，同時其代謝過程產生的毒素也給人類的健康帶來危害.因此研究其致病機制對于該病的防治尤為重要.而在鐵皮石斛種植過程，嚴重制約其生產的重要病原菌即時黑斑病，該病在氣候合適的條件下發病率較高，造成鐵皮石斛的大量減產，因此本文對其病原的生長發育和侵染過程進行了觀察，以期為該病害的防治提供依據.

通過染色后進行顯微鏡觀察，發現細極鏈格孢以單個分生孢子著陸于寄主植物組織表面，然后萌發并產生芽管，芽管可從孢子側面和頂端萌發，隨后從傷口侵入寄主植物體內，該結果與蘋果鏈格孢和銀海棗鏈格孢的侵染過程具有一定相似性［9-10］；當病原菌侵入寄主體內后，分泌毒素（另文發表）或者酶，殺死和降解寄主組織，同時產生許多圍繞細胞間隙生長的菌絲，在傷口周圍的組織中擴展，引起寄主組織解體，從而造成葉片黃化和脫落.

［1］郁美娟，孟慶華，黃德音，等.石斛屬植物有效成分及藥理作用研究［J］.中成藥，2003（11）：918-921.

［2］李戈，李榮英，高薇薇.藥用石斛規模化種植中的病害問題及防治策略［J］.中國中藥雜志，2013，38（4）：485-487.

［3］M. á. Pavón Moreno，I. González Alonso，R. Martín de Santos y，et al. The Importance of Genus Alternaria in Mycotoxins Production and Human Diseases［J］. Nutr Hosp. 2012，27（6）：1772-1781.

［4］張敬澤，鄭小軍.鐵皮石斛黑斑病病原菌的鑒定和侵染過程的細胞學研究［J］.植物病理學報，2004，34（1）：92-94.

［5］桑維鈞，李小霞，練啟仙，等.赤水金釵石斛黑斑病菌生物學特性及防治研究［J］.云南大學學報，2007，29（1）：90-93.

［6］王仕玉，蕭鳳回.齒瓣石斛病原鏈格孢菌生物學特性研究［J］.華北農學報，2009：243-246.

［7］張敬澤，方鈺蓉，張海松，等.鐵皮石斛黑斑病菌室內藥效試驗［J］. 植物保護，2005，31（1）：44-47.

［8］曹星星.鐵皮石斛病原其菌分離與鑒定及印度梨形孢促生作用研究［D］. 杭州：浙江大學，2015.

［9］張彩霞，陳瑩，李壯，等.蘋果鏈格孢菌與寄主葉片互作的超微結構研究［J］.西北植物學報，2012，32（1）：0106-0110.

［10］孫思，王軍.五種整葉透明染色法顯微觀察鏈格孢侵染銀海棗的比較試驗［J］. 陜西農業科學，2005（5）：40，49.

［責任編輯 魯海菊］

Microscopic Observation on Development of Alternaria Tenuissima and Its Infection on Dendrobium Officinale

WANG Zheng-hong1，LI Xiang1，YANG Wen-chao1，DING Li1，CHEN Jun-mei1，XUE Chun-Li1，PAN Zheng-qiong2，KONG Qiong1，YANG Shen-xuan1
（1.College of Life Science and Technology，Honghe University，Mengzi 661199，China；2.Agricultural Techniques Extension Center of Mengzi City，Mengzi 661199，China）

Alternaria tenuissima was a pathogen of black spot in Dendrobium officinale. The development of Alternaria tenuissima and its infection process on leaves of Dendrobium officinale were observed in this paper. The results showed that growth rate of Alternaria tenuissima was fast，infected host by wound，then it could germinate and colonize on leaves of Dendrobium officinale. Conidia of Alternaria tenuissima germinated in 12h，hyphae forming in 24h，conidiophores producing in 3-4d of inoculation with some chain-like spores，then a large amount of hyphae and conidia were formed in 5-6d，and covering on wound tissue of host.

Alternaria tenuissima； Development； Dendrobium officinale； Infection

S432

A

1008-9128（2016）05-0049-03

10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.05.013

2015-03-30

云南省教育廳項目（2015Y451）；紅河學院大學生創新創業訓練計劃項目（DCXL1305）；紅河學院大學生科技創新基金（SZ1408）；紅河學院校級委托項目（13WT001）；紅河學院碩士點植物保護一級學科建設項目；紅河學院大學生創新創業實踐訓練平臺建設項目（CXSJ1304）

汪正紅（1993-），女，云南施甸人，紅河學院生命學院學生；李祥（1993-），男，云南富源人，紅河學院生命學院學生。

孔瓊（1976-），女，云南宣威人，副教授，博士，研究方向：植物抗病性研究。