成人慢性ITP患者外周血CD4+CD25+CD127-/low調節性T細胞、TCRv24+v11+NKT細胞和Th1/Th2細胞因子的變化

邵鳳，徐瑞龍，鄭昭璟，馬擁軍，胡少龍

成人慢性ITP患者外周血CD4+CD25+CD127-/low調節性T細胞、TCRv24+v11+NKT細胞和Th1/Th2細胞因子的變化

邵鳳，徐瑞龍，鄭昭璟，馬擁軍，胡少龍

目的探討成人慢性特發性血小板減少性紫癜（ITP）患者外周血自然殺傷T細胞（NKT）和CD4+CD25+調節性T細胞（Tregs）的變化及關系。方法利用多色流式細胞術檢測ITP患者和健康體檢者外周血NKT和Tregs細胞，雙色流式細胞術檢測外周血網織血小板（RP）數量，CBA技術結合流式細胞術分析血清IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-水平。結果慢性ITP組RP高于健康對照組（＜0.05）；但兩組NKT細胞比例、11種血清細胞因子水平、Th1/Th2型細胞因子比值及1型/2型細胞因子比值差異均無統計學意義（均＞0.05）。Plt計數＜20×109/L的慢性ITP患者組RP及NKT高于健康對照組和Plt計數＞20×109/ L的慢性ITP患者組（均＜0.05）。慢性ITP患者外周血Plt計數與NKT細胞呈負相關（=-0.373，=0.033）。ITP組患者外周血Tregs和NKT細胞無關，但是Tregs細胞與Th1/Th2細胞因子比值呈正相關（=0.451，=0.011），血小板數與血清IL-12p70、IFN、IL-4及TNF也呈正相關（=0.354、0.365、0.354、0.366，均＜0.05）。結論NKT細胞和Tregs細胞可能與慢性ITP患者中細胞因子分泌的異常有關。

紫癜，血小板減少性，特發性，慢性；自然殺傷T細胞；調節性T細胞；細胞因子譜；網織血小板

特發性血小板減少性紫癜（ITP）是一種以1型T細胞反應為主的自身免疫性疾病，以外周血血小板計數（Plt）持續＜100×109/L為特征［1-4］。CD4+CD25+調節性T細胞（Tregs）和自然殺傷T細胞（NKT）是兩種具有免疫調節功能的T細胞亞群。研究證明，活化的NKT細胞能通過IL-2依賴機制調節Tregs細胞的功能，而Tregs細胞能通過細胞接觸依賴機制抑制NKT細胞的增殖、細胞因子分泌和細胞毒活性［5］。本研究對慢性ITP患者外周血NKT、Tregs、血清細胞因子譜進行分析，探討上述因素在ITP中的變化。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2008年1月至2010年3月浙江省金華中心醫院就診的活動期慢性ITP患者68例，符合慢性ITP的診斷標準［6］。其中男40例，女28例；年齡（43.82±2.46）歲；PLT（26.69± 3.90）×109/L。另選年齡、性別匹配的同期健康體檢者38例為健康對照組，其中男24例，女14例；年齡（38.53±1.97）歲；PLT（230.84±11.29）×109/L。受試者在標本采集前2周內均未進行激素治療或其他可以影響血小板代謝的藥物。按照Plt將慢性ITP患者分為兩組，即＜20×109/L和＞20×109/L。

1.2外周血單個核細胞（PBMNC）的分離受試者靜脈穿刺6 ml，用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，以等量0.9％氯化鈉注射液稀釋后置于6 mlLympho-Prep密度梯度分離液上置水平離心機800 r/min室溫離心20 min；以毛細滴管吸取介于分離液和血漿層間的單個核細胞轉移至另外一根試管內，加入等量0.9％氯化鈉注射液，300 r/min室溫繼續離心10 min；去上清，漩渦振蕩重懸單個核細胞，以pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，重復3次；最后PBS重懸細胞并調節細胞濃度為5×106/ml待用。

1.3網織血小板（RP）的檢測利用EDTA-K2抗凝全血，在樣品采集后2 h內完成。在對照管和測定管中加入5 l PE熒光標記血小板膜糖蛋白（CD41-PE）抗體，PBS 30l，加混勻全血標本5l，漩渦振蕩混勻后避光室溫孵育15 min；孵育后在測定管中加入IOSTONⅢ10倍稀釋的噻唑橙試劑（TO）1 ml，在對照管中加入IOSTONⅢ液1 ml，避光室溫孵育1h后上機檢測。檢測時以SSC對數放大信號（SSC Log）和CD41設門識別血小板。CD41+TO+的顆粒為RP。利用對照管進行TO陽性域值的設定。每次實驗至少計數5 000個血小板，同時每次測定均平行檢測Plt正常人的RP。RP的結果以占全部血小板的百分比表示。

1.4CD4+CD25+CD127-/lowTregs的檢測采用三色流式細胞術檢測Tregs細胞。取2根12 mm×75 mm流式試管分別標記同型對照和測試管，按照試劑說明書進行抗體標記染色；吸取20l Cocktail of FITC anti-human CD4和PE anti-humanCD25至試管底部，在同型對照管中加入IgG1-PE-Cy5 10l，在測試管中加入CD127-PE-Cy5 20 l；每管中均加入100 l5×106/ml的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光、室溫孵育15 min；每管中加入PBS 2 ml混勻，置水平離心機350 r/min室溫離心5min；棄上清，加0.5ml PBS重懸細胞、待測。流式細胞術分析中，以SSC/FSC結合SSC/CD4設門圈定CD4+淋巴細胞分析其中CD4+CD25+CD127-/low細胞占CD4+的百分比即為Tregs細胞水平。每次測試至少檢測70 000個CD3+細胞。

1.5TCRv 24+v 11+NKT的檢測采用三色流式細胞術檢測NKT細胞。取2根12 mm×75 mm流式試管分別標記同型對照和測試管；吸取10 l CD3-PECy5至試管底部，在對照管中加入IgG1-FITC、IgG2a-PE各20 l，在測試管中加入V 24-FITC、V 11-PE各20l；每管中均加入100 l細胞密度為5×106/ml的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光室溫孵育15min；每管中加入PBS 2ml混勻；置水平離心機350 r/min室溫離心5 min；棄上清，加0.5 mlPBS重懸細胞、待測。以SSC/FSC結合SSC/CD3設門圈定CD3+細胞分析其中V 24+V 11+占CD3+的百分比即為NKT細胞的水平。每個測試至少檢測100 000個CD3+細胞。

1.6Th1/Th2細胞因子譜分析受試者采集不抗凝靜脈血3 ml靜置，待血清析出后置800 r/min離心機離心5 min，收集血清至1 mlEppendorf管并做好標簽，置-76℃超低溫冰箱保存。檢測時將標本置37℃水浴箱，采用CBA Human Th1/Th211plex試劑盒測定11種細胞因子（IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-），按說明書要求進行。

1.7統計方法采用SPSS16.0和Graph Pad Prism4.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準誤表示，兩組比較采用檢驗；多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；相關分析采用線性回歸法。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ITP患者和健康對照者外周血RP水平慢性ITP組外周血RP的比例為（10.08±3.33）％，高于健康對照組（［1.82± 0.26）％，=2.474，＜0.05］（封三彩圖4）。Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組RP為（17.53±7.56）％，顯著高于健康對照組和Plt＞20×109/L組（［4.95±1.37）％，=5.48，均＜0.05］，而后兩組差異無統計學意義（＞0.05）。

2.2ITP患者和健康對照者外周血NKT細胞水平慢性ITP組PBMNCs 中NKT細胞的比例為（0.13±0.03）％，對照組為（0.09±0.03）％，兩者差異無統計學意義（=0.845，＞0.05）（封三彩圖5）。Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT為（0.22±0.05）％，顯著高于健康對照組的和Plt＞20×109/L組（［0.05±0.01）％，=7.27，均＜0.05］，而后兩組差異無統計學意義（＞0.05）。

2.3ITP患者和健康對照者外周血Tregs細胞水平慢性ITP組外周血Tregs細胞占CD4細胞的（3.97±0.44）％，對照組為（3.70±0.31）％，兩者差異無統計學意義（=0.50，＞0.05）（封三彩圖6）。Plt ＜20×109/L慢性ITP組（［4.21±0.67）％］，Plt＞20×109/L組（［3.78±0.60）％］及對照組Tregs細胞比例差異無統計學意義（=0.24，＞0.05）。

2.4ITP患者和健康對照者血清Th1/ Th2細胞因子水平兩組在11種血清細胞因子水平上差異均無統計學意義（≤1.67，均＞0.05）（表1）。慢性ITP組和對照組Th1/Th2型細胞因子比值差異無統計學意義（3.77±1.346.67± 3.45，=0.94，＞0.05）；1型/2型細胞因子比值差異無統計學意義（3.14±1.07 4.23±1.48，=0.60，＞0.05）。Plt＞20×109/L的慢性ITP組血清IFN-、IL-12p70、IL-4及TNF-水平要高于另外兩組，但差異無統計學意義（≤1.29，均＞0.05）（表2）。Plt＜20×109/L的慢性ITP組（3.14±1.20）、Plt＞20×109/L組（4.26±2.21）及對照組Th1/Th2型細胞因子比值差異無統計學意義（=0.48，＞0.05）；3組1型/2型細胞因子比值分別為3.02±1.05、3.25±1.76及4.23±1.48，差異也無統計學意義（=0.18，＞0.05）。

2.5ITP患者外周血NKT、Tregs、細胞因子與Plt的關系慢性ITP患者外周血Plt與NKT細胞呈負相關（=-0.373，=0.033）。Tregs和NKT細胞間無相關關系，但Tregs細胞與Th1/Th2細胞因子比值間呈正相關關系（=0.451，=0.011）。同時，Plt與血清IL-12p70、IFN、IL-4及TNF水平也呈正相關（= 0.354、0.365、0.354、0.366，均＜0.05）。

表1　慢性ITP組和對照組血清細胞因子表達水平pg/ml

表2　不同Plt數的慢性ITP患者和健康對照細胞因子表達水平pg/ml

3　討論

ITP的發病機制涉及機體失去對自身血小板抗原的外周耐受從而導致自體免疫細胞識別自身血小板抗原、產生自身反應性T細胞和自身抗體，最后導致血小板的異常破壞。目前認為NKT和 Tregs細胞是機體維持外周耐受最為重要的兩種免疫調節細胞。

Johannson等［7］發現ITP患者外周血NKT細胞的增殖潛力顯著減低，因此認為NKT細胞在ITP發病中發揮重要作用。Johannson等［8］在1例女性ITP患者中發現外周血NKT細胞的顯著增高，并且這種增加的NKT細胞能夠抑制自體CD4+細胞的體外增殖活性，推測NKT細胞對ITP患者起保護作用。這一觀點得到Ho等［9］的支持。本研究發現，ITP患者外周血NKT細胞數量依血小板數量減少程度的不同而有顯著差異，即Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT細胞數量高于對照組和Plt＞20×109/L組，且ITP患者外周血NKT細胞與Plt呈負相關（=-0.373，=0.033）。

NKT和Tregs細胞在體內相互影響對方的功能。Azuma等［10］發現，Tregs細胞通過細胞-細胞接觸機制抑制CD4+和CD4-CD8-NKT細胞的增殖、細胞因子（IFN-，IL-4，IL-13，IL-10）分泌和細胞毒活性，而NKT細胞、尤其是CD4+NKT細胞通過分泌IL-2促進Tregs細胞的增殖［11］。本研究未發現NKT細胞和Tregs細胞間的關系。血清細胞因子分析顯示，ITP患者和健康對照組在血清IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-水平，Th1/Th2細胞因子比值（反應抗原特異性免疫反應Th0細胞極化方向）和1型/2型細胞因子比值（反應機體總體免疫反應性質）差異均無統計學意義（均＞0.05），推測可能與檢測標本間結果數據的離散度太大有關。但相關分析表明，ITP患者血小板數量與IL-12p70、IFN-、IL-4及TNF-呈正相關，即細胞因子在ITP中發揮作用的觀點。由于ITP的診斷仍是排除性的［12］，加之疾病本身的異質性，因此很多的研究結果之間很難進行有效的比較。正如Zehnder等［13］認為，對血小板抗原特異性T和B細胞進行可靠識別和定量是今后ITP研究的方向之一。相應地，結合血小板抗原特異性T和B細胞進行NKT、Tregs及細胞因子表達譜分析將會極大地提高相關研究的可靠性。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.048

R554+.6；R558+.2

A

1671-0800（2016）08-1069-04

2016-05-15

（本文編輯：孫海兒）

316100浙江省舟山，舟山市普陀區人民醫院（邵鳳）；寧波開發區中心醫院（徐瑞龍）；金華市中心醫院（鄭昭璟、馬擁軍、胡少龍）

徐瑞龍，Email：ruilongxu@sina.com