芍藥苷對HepG2肝癌細胞凋亡的誘導作用

張亞武，權柯

1蘭州大學第二醫院膽胰外科，甘肅蘭州730000；2甘肅中醫藥大學

芍藥苷對HepG2肝癌細胞凋亡的誘導作用

張亞武1，權柯2

1蘭州大學第二醫院膽胰外科，甘肅蘭州730000；2甘肅中醫藥大學

目的：探討芍藥苷（Paeoni florin）對H epG 2肝癌細胞凋亡的誘導作用，并考察其作用機制。方法：用不同濃度芍藥苷（0.5，2 m g/m L）對HepG 2肝癌細胞進行培養，采用MTT法檢測細胞活力，酶標法檢測Caspase 3活性，western blot法檢測N F-κB信號通路相關蛋白表達。結果：隨著給藥濃度的增加，芍藥苷能逐漸降低H epG 2肝癌細胞活力，在48小時抑制率最高；并能提高Caspase 3活性，抑制細胞核內N F-κB p65磷酸化，IκBα磷酸化，從而促進細胞凋亡。結論：芍藥苷可能通過N F-κB信號通路誘導H epG 2肝癌細胞凋亡，達到抗腫瘤效果。

HepG 2肝癌細胞；凋亡；NF-κB信號通路；磷酸化；芍藥苷

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，目前其主要治療手段為手術，但術后易復發，轉移率較高。因此，尋求有效治療肝癌，降低復發率的藥物成為研究熱點。

芍藥苷（Paeonif1orin，PF）是從毛茛科植物芍藥（Paeonia Lactiflora Pa11）中提取的有效單體成份，能抗各種腫瘤活性［1-4］。已有報道芍藥苷可上調Bax，p53表達，下調Bc1-2表達，促進HepG2肝癌細胞凋亡［1］，但其具體機制尚不可知。并且芍藥苷可通過抑制NF-κB信號通路，抑制胃癌細胞增殖［2-3］，本研究在此基礎上探討芍藥苷是否通過抑制NF-κB信號通路來誘導HepG2肝癌細胞凋亡。

1　材料與方法

1.1細胞系與藥物HepG2肝癌細胞購自美國標準生物品收藏中心（ATCC），細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中。芍藥苷購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2試劑與儀器四唑鹽試劑（MTT）（sigma公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；ECL超敏發光液（碧云天生物技術研究所）；小鼠p65抗體（碧云天生物技術研究所）；β-actin（碧云天生物技術研究所）；兔IκBα抗體（Epitmics公司）；兔抗pp65抗體（Epitmics公司）；Caspase 3分光光度法檢測試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；胎牛血清（Gbico公司）；DMEM培養基（Gbico公司）；CO2培養箱（Thermo Scientific公司）；超凈工作臺（Thermo Scientific公司）；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀（瑞士TECAN集團公司）；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統（Bio-Rad公司）。

1.3方法

1.3.1MTT實驗將80%左右融合的HepG2肝癌細胞，消化，細胞濃度調整為4×103個/mL，接種，37℃5% CO2培養箱中培養24小時。加入含PF，終濃度為0.5、1、2mg/mL的DMEM培養基中，繼續培養24、48、72小時，加MTT（5mg/mL）20μL，培養4小時后棄上清，加DMSO 150 μL，10分鐘左右后570 nm處測定OD值。計算藥物對細胞生長的抑制率。

1.3.2Caspase 3酶活性檢測將80%左右融合的HepG2肝癌細胞，消化，細胞濃度調整為4×103個/mL，接種，37℃5%CO2培養箱中培養48小時。加入含PF，終濃度為0.5、1、2 mg/mL的DMEM培養基中，按照Caspase 3酶活性檢測試劑盒說明書進行操作，收集細胞，裂解，加底物，顯色，于405 nm處測定吸光度。

1.3.3w est ern bl ot收集細胞，加入RIPA裂解液，收獲蛋白。根據BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。跑SDS凝膠電泳，后濕法磚膜。孵一抗過夜，二抗1小時后，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

1.4統計學方法數據采用SPSS 17.0軟件統計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1芍藥苷對H epG 2肝癌細胞增殖抑制作用隨著給藥濃度的增加，芍藥苷對HepG2肝癌細胞抑制作用逐漸增強，在2 mg/mL時抑制率最大；隨著24、48、72小時給藥時間的增加，芍藥苷對HepG2肝癌細胞抑制作用也逐漸增強，其中48、72小時作用強度一致，所以在后續實驗中選取48小時作為給藥濃度，見表1。

表1　芍藥苷對H epG 2肝癌細胞增殖抑制作用（±s）

表1　芍藥苷對H epG 2肝癌細胞增殖抑制作用（±s）

注：與前一劑量組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

組別劑量/（m g·m L-1）抑制率/% 24 h48 h72 h對照組00.1±0.023.0±0.33.1±0.5 0.53.5±0.8*14.5±2.1**14.3±2.4**芍藥苷16.5±0.5*23.7±3.6**23.8±3.8**2 10.7±1.9**35.3±5.1**35.2±4.3**

2.2芍藥苷對HepG 2肝癌細胞Caspase 3活性的影響芍藥苷（0.5、1、2 mg/mL）能提高HepG2肝癌細胞Caspase 3活性，并呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　芍藥苷對HepG 2肝癌細胞Caspase 3活性的影響

2.3芍藥苷對HepG 2肝癌細胞NF-κB通路的影響芍藥苷能抑制HepG2肝癌細胞細胞核NF-κB p65蛋白磷酸化，并呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05），而對細胞核內p65表達無任何影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。因此繼續探討NF-κB p65上游蛋白的影響，結果發現芍藥苷能抑制HepG2肝癌細胞IκBα蛋白磷酸化，并呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05），但對IκBα自身表達無任何影響，見圖2。

圖2　芍藥苷對H epG 2肝癌細胞N F-κB通路的影響

3　結論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其危害僅次于肺癌，目前其主要治療手段為手術，但即使獲得手術切除機會，其復發、轉移率依然較高［5-9］。因此，尋求有效治療肝癌，降低復發率的藥物成為當務之急。而抗腫瘤藥物包括化療藥物、激素、生物制劑都能引起腫瘤細胞發生調亡。凋亡對腫瘤的抑制起重要作用，并且抑制NF-κB活性促進細胞凋亡是治療腫瘤的有效手段之一［10］。芍藥苷可通過抑制NF-κB信號通路來抑制胃癌細胞增殖［2-3］，所以本研究擬嘗試用不同濃度（0.5、1、2 mg/mL）芍藥苷對HepG2肝癌細胞進行培養，結果表明隨著給藥濃度的增加，芍藥苷可逐漸降低細胞活力，抑制腫瘤細胞的增殖，在48小時時抑制率達到最高點。

Caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，其被合成后通常以非活化的酶原形式存在于細胞質中，在多種凋亡信號刺激下經蛋白水解作用被激活成活化形式，可對多種蛋白底物進行降解，在細胞凋亡過程中起關鍵作用，被認為是整個凋亡級聯反應的一個關鍵調節點［11］。Caspase 3在HepG2肝癌細胞中活性高于給藥組［12-14］，在本研究中，與對照組比較，芍藥苷（0.5、1、2 mg/mL）呈劑量依賴性抑制Caspase 3活性。

NF-κB是一類廣泛存在于腫瘤細胞內的重要轉錄因子，是多信號轉導途徑的匯聚點，參與組織細胞的免疫調節，炎癥反應，生長分化和凋亡等［15-16］。未受刺激時與IκB結合，當受到刺激時，IκB磷酸化，釋放NF-κB，使之恢復轉錄活性并從細胞質轉移到細胞核內，調節相關基因的表達。NF-κB在各種腫瘤細胞中均過表達［17］，朱開梅等［18］報道八角中莽草酸可通過抑制NF-κB p65活性，抑制人肝癌HepG2細胞增殖。本研究結果表明芍藥苷能抑制HepG2肝癌細胞NF-κBp65，IκBα蛋白磷酸化，最終提高Caspase 3活性，誘導腫瘤細胞凋亡。

因此，芍藥苷可能通過NF-κB信號通路，提高Caspase 3活性，促進HepG2肝癌細胞的凋亡。

［1］晏雪生，李瀚旻，彭亞琴，等.芍藥苷對人肝癌細胞Hep-G2凋亡及其調控基因的影響［J］.中華中醫藥學刊，2007，25（7）: 1346-1347.

［2］方申存，戴偉，吳昊，等.芍藥苷對人胃癌SG C7901/V CR細胞增殖抑制作用及其機制研究［J］.南京醫科大學學報：自然版，2010，30（5）:636-640.

［3］Fang S，Zhu W，Zhang Y，et al.Paeoni florin modulates multi drug resistance of a human gastric cancer cell line vi a the inhibition of NF-κB activation［J］.Mol Med Rep，2012，5（2）:351-356.

［4］Lu JT，He W，SongSS，et al.Paeoni florin inhibited the tumor invasion and metastasis in human hepato cellular carcinoma cells［J］.Brat is l Lek Listy，2014，115（7）:427-433.

［5］郭明，伍周玲，王春歌，等.黃芩苷-金屬配合物的合成及其抗腫瘤活性研究［J］.藥學學報，2014，49（3）:337-345.

［6］吳菲，林國楨，張晉昕.我國惡性腫瘤發病現狀及趨勢［J］.中國腫瘤，2012，21（2）:81-85.

［7］魏沙.2002—2010年我國城市惡性腫瘤死亡率變化趨勢分析［J］.實用預防醫學，2013，20（1）:111-113.

［8］李鐘聲.原發性肝細胞癌的治療進展［J］.安徽醫學，2009， 30（7）:830-832.

［9］蔡欣然，黃長玉，周良藝.原發性肝癌根治術后不同復發時期高危因素及療效研究［J］.實用腫瘤雜志，2010，25（5）: 560-563.

［10］Baud V，Karin M.Is N F-kappaB a good target for cancer therapy？Hopes and pitfalls［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8（1）:33-40.

［11］Porter A G，Janicke RU.Emerging roles of caspase-3 in apopt os is［J］.Cell Death Differ，1999，6（2）:99-104.

［12］Xiang Q，M aY，Dong J，et al.Carnosic acid induces apopt osi s associ at ed with mit ochondri al dysfuncti on and Akt inact i vation in HepG 2 cell s［J］.Int J Food Sci Nutr，2015，66（1）：76-84.

［13］Zhang H，Guo Z，Han L，et al.The antitumor effect and mechanism of tai pei ni ne A，a new C19-dit erpenoid al kal oi d fr om Aconi tumt ai pei cum，on the HepG 2 hum an hepat ocel l ul ar carci nom a cel l l i ne［J］.J BU O N，2014，19（3）:705-712.

［14］Sudan S，Rupasi nghe H P.Fl avonoi d-enri ched appl e fraction A F4 i nduces cell cycle arrest，DNA topoisomerase II inhi bition，and apoptosis in human liver cancer HepG 2 cells［J］.Nutr Cancer，2014，66（7）:1237-1246.

［15］Zhang Y H，Yan HQ，Wang F，et al.TIPE2 inhi bits TN F-α i nduced hepatocellular carcinoma cell metastasis via Erk1/2 downregul at i on and N F-κB activation［J］. Int J Oncol，2015，46（1）:254-264.

［16］Shan RF，Zhou Y F，Peng A F，et al.Inhi bition of Aurora-B suppresses H epG 2 cell invasi on and migration via the PI3K/A kt/N F-κB si gnaling pathway in vitro［J］. Exp Ther Med，2014 8（3）:1005-1009.

［17］崔嵩，劉學鋒，吳斌.N F-κB在腫瘤中的研究進展［J］.現代腫瘤醫學，2009，17（1）:134-137.

［18］朱開梅，顧生玖，顧小文，等.八角中莽草酸對人肝癌H epG 2細胞增殖及N F-κB蛋白表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（1）:126-129.

Apoptotic Induction Effects of Paeoniflorin on Hepatoma Carcinoma Cells

ZHANG Yawu1，QUAN Ke2
1 Biliary Pancreatic Surgery Department of Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730000，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore apoptotic induction effects of paeoniflorin on hepatoma carcinoma cells（HepG2），and to investigate its mechanism.Methods:HepG2 cells were cultivated with different concentrations of paeoniflorin（0.5，2 mg/mL），cell viability was detected by MTT method，Caspase 3 activity measured by enzyme linked immunosorbent assay and the expression of NF-κB signaling pathway related protein by western blot method. Results:As the concentrations of the drug increased，paeoniflorin could decrease the viability of HepG2 cells gradually，and the inhibition rate reached the highest within 48 hours；it increased Caspase 3 activity，inhibited the phosphorylation of NF-κB p65 and IκBα，thereby to promote cellular apoptosis.Conclusion:Paeoniflorin could obtain anti-tumor effects by inducing the apoptosis of HepG2 cells via NF-κB signaling pathway.

hepatoma carcinoma cells；apoptosis；NF-κB signaling pathway；phosphorylation；paeoniflorin

R735.7

A

1004-6852（2016）05-0023-03

2015-02-19

張亞武（1971—），男，碩士學位，副主任醫師。研究方向：消化道腫瘤的診治。