甜葉菊中總多酚及總多糖含量測(cè)定*

何巧麗，李柯翱，季志紅，田樹革

1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2新疆奇康哈博維藥有限公司；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

甜葉菊中總多酚及總多糖含量測(cè)定*

何巧麗1，李柯翱2，季志紅2，田樹革3△

1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2新疆奇康哈博維藥有限公司；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

目的:建立測(cè)定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量的方法，并測(cè)定其含量。方法:分別以沒食子酸和葡萄糖作為測(cè)定總多酚和總多糖含量的對(duì)照品，采用可見分光光度法測(cè)定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的含量。結(jié)果:測(cè)得甜葉菊提取物中總多酚總多糖含量分別為1.36 m g、1.73 m g。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)單可行，重現(xiàn)性良好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可信，可以作為甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量的測(cè)定方法。

甜葉菊提取物；總多酚；總多糖；含量測(cè)定

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），別名甜菊、糖草、屬菊科（Compositae），斯臺(tái)維亞屬，是一種多年生菊科草本植物。作為一種非糖、非營養(yǎng)型的甜味劑，甜葉菊符合現(xiàn)代健康飲食的理念，還具有清熱、利尿、調(diào)節(jié)胃酸的功效。甜葉菊葉子的化學(xué)成分多種多樣，主要成分是甜葉菊總糖苷，甜葉菊的根、莖、葉中含有甜葉菊糖甙，含量占10%左右。甜葉菊糖甙具有高甜度（為蔗糖的200～300倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特性［1］。此外，還富含黃酮類成分。截止目前，甜葉菊中的ent-貝殼杉烯型二萜類是研究最為深入的一類成分［2］。

預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明甜葉菊中還含有多糖和酚酸類成分。總糖是單糖、低聚糖、多糖等化合物的總和，其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓、提高記憶力等作用［2-3］。植物多酚類化合物在自然界分布廣泛，具有抗氧化、清除自由基、與金屬離子發(fā)生絡(luò)合、與蛋白質(zhì)形成多種生理學(xué)活性等功能［4］，是有效的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑［5］。此外，有些多酚類化合物本身具有抗腫瘤作用［6］。

本研究采用可見分光光度法測(cè)定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的含量，建立甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量測(cè)定方法，為甜葉菊資源的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1藥材甜葉菊為采集于新疆阜康市（2013年9月，原料藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院徐海燕老師鑒定為菊科多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）的干燥葉片。

1.2試劑葡萄糖對(duì)照品（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；沒食子酸（批號(hào)：20130415，成都市科龍化工試劑廠）；鎢酸鈉、蒽酮、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水、甲醇、乙醇、碳酸鈉、硫酸等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

1.3儀器AK-100搖擺式中藥粉碎機(jī)（溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司）；METTLER TOLEDO型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-200KDE型超聲清洗器（昆山市超生儀器有限公司）；B-260水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華）。

2　方法與結(jié)果

2.1福林酚試劑的制備［7］稱取鎢酸鈉100.0g，鉬酸鈉25.0 g，用700 mL蒸餾水溶解于圓底燒瓶中，加入磷酸（85%）50 mL和100 mL濃鹽酸充分混勻，小火加熱回流12小時(shí)，放冷，再加入150 g硫酸鋰，50 mL蒸餾水及0.2 mL雙氧水，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，使得雙氧水完全揮發(fā)，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾，于棕色瓶中避光儲(chǔ)存。試液應(yīng)呈亮黃色。如放置后變?yōu)榫G色，可加雙氧水0.2 mL，煮沸15分鐘即可。

2.2沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取2.2 mg沒食子酸對(duì)照品，用蒸餾水溶解，定容至50 mL容量瓶中，得濃度為0.044 mg/mL的沒食子酸對(duì)照品溶液。

2.3葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取0.100 0 g葡萄糖對(duì)照品，用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為1 mg/mL的葡萄糖照品溶液。

2.4供試品溶液的制備采用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)選甜葉菊中總多酚及總多糖的提取工藝。精密稱取甜葉菊粉末（過三號(hào)篩）約1.0 g，加入25倍量水于90℃回流提取兩次，1 h/次，合并濾液，蒸干成粉末。再精密稱取粉末約5 mg，置于10 mL的容量瓶中定容至刻度線，充分搖勻，即得供試品溶液。

2.5測(cè)定波長(zhǎng)的選擇準(zhǔn)確吸取沒食子酸對(duì)照品溶液1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入福林試劑1 mL，搖勻，靜置2分鐘，再加入2 mL15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，混勻，75℃水浴10分鐘，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描沒食子酸及樣品的最大吸收波長(zhǎng)，沒食子酸對(duì)照品的掃描結(jié)果顯示其最大吸收波長(zhǎng)為760 2 nm，綜合文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收波長(zhǎng)，確定在752 nm處測(cè)定甜葉菊提取物的總多酚含量。準(zhǔn)確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，再從中分別精密吸取1 mL于刻度試管中，加入硫酸蒽酮試液4 mL，搖勻，靜置15分鐘，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，在常溫下于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描葡萄糖及樣品的最大吸收波長(zhǎng)，葡萄糖對(duì)照品的掃描結(jié)果顯示其最大吸收波長(zhǎng)為580 2 nm，綜合文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收波長(zhǎng)，確定在588 nm處測(cè)定甜葉菊提取物的總多糖含量。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和線性關(guān)系的考察

2.6.1總多酚對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取沒食子酸對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL置于10 mL容量瓶中，加入福林試劑1 mL，搖勻，靜置2分鐘，再加入2 mL 15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，混勻，75℃水浴10分鐘，在752 nm處測(cè)定其吸光度值。以沒食子酸濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：A=61.364C+0.147 8（r2=0.996 8），結(jié)果表明，沒食子酸在1.76～8.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2總多糖對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，再從中分別精密吸取1 mL于刻度試管中，加入硫酸蒽酮試液4 mL，搖勻，靜置15分鐘，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，于常溫在588 nm處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：A=10.86C-0.147（r2=0.998 8），結(jié)果表明，葡萄糖在0.04～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7精密度實(shí)驗(yàn)

2.7.1總多酚精密度實(shí)驗(yàn)分別精密吸取6份沒食子酸對(duì)照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果顯示吸光度RSD值為1.17%，表明該方法精密度良好。

2.7.2總多糖精密度實(shí)驗(yàn)分別精密吸取6份葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2項(xiàng)”下方法操作，結(jié)果顯示吸光度RSD值為1.54%，表明該方法精密度良好。

2.8穩(wěn)定性考察

2.8.1總多酚穩(wěn)定性考察分別精密吸取室溫下放置0、5、10、15、20、30分鐘的沒食子酸對(duì)照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，在752 nm處測(cè)定其吸光度值，結(jié)果表明吸光度RSD值為1.26%，表明其在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.2總多糖穩(wěn)定性考察分別精密吸取室溫下放置0、1、2、3、6、12小時(shí)的葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2項(xiàng)”下方法操作，結(jié)果顯示吸光度RSD值為1.46%，表明其在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率

2.9.1總多酚加樣回收率采用加標(biāo)回收法，精密量取已知量的甜葉菊干燥樣品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”項(xiàng)下方法將其制成供試品溶液，從中吸取6份已知總多酚含量的水提取液0.2 mL，各加入對(duì)照品溶液0.5 mL，按照“2.6.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其混合溶液的吸光度值，并計(jì)算其回收率，結(jié)果表明甜葉菊提取物中總多酚的平均回收率為98.53%，RSD為2.25%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，見表1。

表1　甜葉菊提取物總多酚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9.2總多糖加樣回收率采用加標(biāo)回收法，精密量取已知量的甜葉菊干燥樣品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”項(xiàng)下方法將其制成供試品溶液，從中吸取6份已知多糖含量的水提取液0.1mL，取0.2mL葡萄糖對(duì)照品溶液，按照“2.6.2”項(xiàng)下方法測(cè)定混合溶液的吸光度值，并計(jì)算其回收率，結(jié)果表明甜葉菊提取物中總多糖的平均回收率為100.67%，RSD為1.98%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，見表2。

表2　甜葉菊提取物總多糖回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3　含量的測(cè)定

甜葉菊提取物中總多酚、總多糖含量測(cè)定。按“2.4”項(xiàng)下方法，從10 mL水提取液中精密吸取0.5 mL稀釋液，并按照“2.6.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度值。根據(jù)線性方程計(jì)算樣品中總多酚的含量；按“2.4項(xiàng)”下的方法，從10 mL水提取液中精密吸取0.3 mL的稀釋液，并按照“2.6.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其吸光度值。根據(jù)線性方程計(jì)算樣品中總多糖的含量，見表3。

表3　甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量（n=3）

4　討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甜葉菊提取物中含有一定量的總多酚和總多糖，采用可見分光光度法測(cè)定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量可行，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，精密度高，可見分光光度法可以作為檢測(cè)甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的一種方法。

本研究采用2010版中國藥典中蒽酮-硫酸法測(cè)定甜葉菊提取物中的總多糖，該法具有快速方便，價(jià)格低廉，且不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。

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Content Determination of Total Polysaccharide and Total Polyphenols of TianYeJu

HE Qiaoli1，LI Keao2，JI Zhihong2，TIAN Shuge3△

1 TCM College of Xinjiang Medical university，Urumqi，830011，China；2 Xinjiang QiKang HaBo Uygur Medicine Co.，LTD；3 Central Lab of Xinjiang Medical University

Objective:To establish the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu［Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl］，and determine their contents.Methods:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were detected by visible spectrophotometric method，gallic acid and glucose were tanked as the control articles of determining total polyphenols and total polysaccharide.Results:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were 1.36 mg and 1.73 mg respectively.Conclusion:The method，simple，feasible，reproducible，accurate and reliable，could be taken as the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu.

the extract of TianYeJu；total polyphenols；total polysaccharide；content determination

R284.1

A

1004-6852（2016）05-0034-03

2015-02-12

自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（編號(hào)2013911135）。

何巧麗（1990—），女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥化學(xué)。

田樹革（1969—），男，教授。研究方向：中藥化學(xué)。