非M3型急性髓系白血病細胞遺傳學及分子生物學特征和預后分析

熊術道，胡林輝，蒲蓮芳，丁洋洋，李曼曼，劉軍，楊冬冬，王會平，張翠

(安徽醫科大學第二附屬醫院血液科　血液病實驗室　安徽醫科大學血液病研究中心,安徽 合肥　230601)

?

非M3型急性髓系白血病細胞遺傳學及分子生物學特征和預后分析

熊術道，胡林輝，蒲蓮芳，丁洋洋，李曼曼，劉軍，楊冬冬，王會平，張翠

(安徽醫科大學第二附屬醫院血液科血液病實驗室安徽醫科大學血液病研究中心,安徽 合肥230601)

目的探討和分析非M3型急性髓系白血病(AML)細胞遺傳學及分子生物學特征以及預后影響因素。方法回歸性分析99例非M3型初治AML患者臨床及實驗室數據，探討和分析患者性別、年齡、初診時白細胞數、血小板數、有無貧血、乳酸脫氫酶水平、染色體核型以及融合基因等因素對AML患者無疾病進展生存時間(DFS)及總體生存時間(OS)的影響。結果患者中位發病年齡為44歲(1～84歲)，中位隨訪時間為12.6月(0.33～59.47月)，化療后達完全緩解(CR)率為62.7%，復發率為44.1%，不同年齡段患者CR率有明顯差異(P=0.035)；單因素及多因素分析顯示老年及染色體數目異常為AML患者OS的獨立預后不良因素，t(8,21)/inv(16)系其獨立預后良好因素。結論老年及染色體數目異常為非M3型AML患者獨立預后不良因素；t(8,21)/inv(16)是其獨立預后良好因素。AML臨床應結合年齡、細胞遺傳學及分子生物學等預后因素進行預后評估，據此制定個體化治療，對延長患者生存時間，提高生活質量，具有重要指導意義。

白血病,髓樣,急性;核型;基因融合;危險因素;預后

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一類起源于髓系造血干/祖細胞的單克隆惡性血液病，其白血病細胞可大量增殖，廣泛浸潤肝、脾、淋巴結等各種組織器官，臨床病程進展迅速，預后不良。近年來，盡管AML的診療取得了一定的進展，但是，除M3型之外的AML患者化療完全緩解后容易復發，難于獲得良好長期預后。研究表明，AML患者的年齡、白細胞數、血小板數、細胞遺傳學和分子生物學等諸多因素可能與疾病預后相關[1]。因此，分析和探討非M3型AML患者臨床及實驗室數據與預后的相關性，可能為該類AML臨床治療及預后評估提供相關線索和依據，對延長其長期生存時間以及提高生活質量可能具有重要的指導意義。

1　資料與方法

1.1研究對象選取2010年10月至2016年3月就診于安徽醫科大學第二附屬醫院血液內科及兒科血液病區初治AML(非M3型)患者99例。所有患者診斷均參照《白血病診斷及療效標準》第3版[2]。其中，5例初治AML患者因病情進展快及經濟等因素放棄治療，本文僅對94例AML(非M3型)患者的臨床及實驗室數據進行進一步的療效及預后相關分析。本研究獲安徽醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準，患者或近親屬對研究方案知情并簽署知情同意書。

1.2臨床及實驗室數據收集收集入組患者的臨床及實驗室檢查等相關數據，包括發病年齡、性別、初診時血常規數據、血清乳酸脫氫酶水平、FAB分型、細胞遺傳學以及分子生物學等實驗室檢測結果。

1.3臨床治療所有AML患者采用以阿糖胞苷為基礎的IA或者DA方案(去甲氧柔紅霉素6～8 mg·m-2或柔紅霉素40 mg·m-2，1次/d×3 d，阿糖胞苷150 mg·d-1×5～7 d)進行誘導治療。緩解后按原方案行鞏固治療，后予以強化維持治療。

1.4療效判斷所有入組患者的療效判斷標準均參照《白血病診斷及療效標準》第3版[2]。總體生存時間(overall survival,OS)定義為第一次診斷時間至死亡或者隨訪結束時間，失訪病例則為失訪日期。無疾病進展生存時間(disease free survival,DFS)定義為第一次診斷時間至第一次復發，死亡或隨訪結束時間，失訪病例則為失訪日期。隨訪時間截止為2016年5月24日。

1.5統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，卡方檢驗用于率的比較，采用Kaplan-Meier生存曲線對OS以及DFS進行分析，采用Log-rank對預后影響因素進行單因素分析，多元COX回歸模型進行預后多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1患者基本資料99例初治AML(非M3型)患者中，男性45例，女性54例，發病年齡1～84歲，中位44歲。兒童患者(≤14歲)24例，成人患者(15～59歲)49例，老年患者(≥60歲)26例(表1)。初診中位白細胞數(WBC) 8.16×109·L-1[(0.55～629)×109·L-1]，中位血紅蛋白(Hb) 83.5 g·L-1(41～340 g·L-1)，中位血小板計數(PLT)30×109·L-1[(5～212)×109·L-1]。細胞遺傳學顯示，99例入組患者中，62例患者骨髓檢出染色體核型異常，檢出率為62.6%。異常核型主要包括t(8,21)/inv(16) 24例，不含t(8,21)/inv(16)染色體結構異常的核型17例，不含t(8,21)/inv(16)染色體數目異常的核型10例，不含t(8,21)/inv(16)的結構以及數目均存在異常的復雜核型9例，正常核型37例。涉及到的染色體數目異常為-5、-7、+8、-14、-16、-17、-18、-20、+22、-Y；涉及到的染色體結構異常為t(16,21)、t(6,14)、del(9p)、del(6q)、del(5q)、del(8q)、del(11q)等。共有33例患者分子生物學檢測出融合基因，其中AML-ETO檢出率為20.2%，CBF-MYH11檢出率為6%，MLL相關融合基因檢出率為4%，HOX11檢出率為4%，TLS-ERG檢出率為2%(表1)。

表1 　AML患者一般臨床及實驗室資料

2.2患者FAB分型及細胞遺傳學或分子生物學特征99例患者按FAB分型，其中M01例，M13例，M254例，M413例，M513例，M62例，未分類13例。M0中1例為染色體結構異常；M1中，2例為正常核型，1例為染色體數目異常；M2中，20例正常核型，2例染色體數目異常，8例染色體結構異常，5例復雜核型，19例t(8,21)異常，inv(16)1例；M4中，6例正常核型，2例染色體數目異常，1例復雜核型，4例inv(16)；M5中，6例正常核型，2例染色體數目異常，4例染色體結構異常，1例復雜核型；M6中，2例染色體數目異常；未分類AML中，6例正常核型，1例染色體數目異常，4例染色體結構異常，2例復雜核型。

而入組的AML患者融合基因檢查結果顯示：M2中，AML-ETO陽性20例(其中1例細胞遺傳學未檢測出t(8,21)易位)，HOX11陽性4例，CBF-MYH11陽性1例，TLS-ERG陽性1例(細胞遺傳學未檢測出t(16;21)(p11;q22))，MLL-AF6，MLL-AF10雙陽性1例；M4中，CBF-MYH11陽性4例(其中1例細胞遺傳學未檢測出inv(16))，MLL-AF10陽性2例， CBF-MYH11，MLL-AF10雙陽性一例；M5中，TLS-ERG陽性1例(細胞遺傳學未檢測出t(16;21)(p11;q22))；M0、M1、M6以及未分類AML中未見融合基因異常。AML的FAB分型與細胞遺傳學及分子生物學特征見表2。

表2　AML(非M3)的FAB分型與細胞遺傳學及分子生物學特征/例

2.3療效及預后分析99例初治AML患者中，只有94例全部完成誘導化療(5例未完成誘導化療的患者中，4例為M2患者，1例為未分類AML)，中位隨訪時間為12.6月(0.33-59.47)。其中59例化療后達到CR(CR率為62.7%)，未緩解35例。26例患者復發，均為骨髓復發，復發率為44.1%。療效分析顯示，不同年齡段之間患者CR率存在明顯差異，差異有統計學意義(P=0.035)；而性別、白細胞數、染色體核型，血小板數等因素均與患者CR率無關(P=0.482,P=0.647,P=0.111,P=0.619)。

2.4相關預后單因素分析94例AML患者中位隨訪時間為12.6月，Kaplan-Meier分析顯示，患者平均生存為(26.8±2.9)月，中位OS 24.0月，平均DFS (21.7±2.4)月，中位DFS 17.4月。隨訪過程中共有52例患者死亡，其中死于復發26例，死于疾病過程中發生的肺部感染，內臟出血，多器官衰竭等并發癥患者26例。將患者按年齡劃分為兒童，成人以及老年組，按染色體核型以及融合基因特征將患者劃分為t(8,21)/inv(16)、正常核型、染色體結構異常核型、染色體數目異常核型、復雜核型，其中t(8,21)/inv(16)中包含染色體未檢測出異常但有分子生物學改變的患者。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，兒童組的OS時間以及DFS時間最長，其次為成人組，最后為老年組，進一步分析顯示，成人組與兒童組之間DFS時間以及OS時間無明顯差異(圖1)。AML伴t(8,21)/inv(16)患者OS時間以及DFS時間最長，其次為正常核型、染色體結構異常核型、復雜核型和染色體數目異常核型(圖2)。而性別、初診時白細胞數、血小板數、有無貧血以及乳酸脫氫酶水平對患者OS時間以及DFS時間均無影響(OS:P=0.117,P=0.754,P=0.281,P=0.261,P=0.525;DFS:P=0.126,P=0.319,P=0.186,P=0.463,P=0.512)。

2.5相關預后多因素分析將單因素分析中對OS以及DFS有影響的因素納入多因素COX回歸分析，年齡段中以老年組為基線水平，結果顯示兒童組以及成人組的OS時間均較老年組長，而DFS時間并無差異；染色體核型分組中，以t(8,21)/ inv(16)為基線水平，結果顯示染色體數目異常對OS以及DFS時間均存在影響(表3)。

圖1　不同年齡段AML患者DFS和OS生存分析

圖2　不同染色體核型的AML患者DFS和OS生存分析

表3　影響AML患者總體生存時間多因素分析

注：Ref:基線水平分組。

3　討論

AML除伴有t(15,17)即M3型具有靶向藥物治療且取得相對較好的臨床療效及預后外，其他類型AML并無明確的靶向藥物，其臨床治療及預后受多種因素影響[3-5]。細胞遺傳學及融合基因等分子生物學檢查對AML分型診斷、治療及預后意義重大[5-6]。本文發現，非M3型AML中，常見的遺傳學及分子生物異常是t(8,21)/ AML-ETO(M2)及inv(16)/ CBF-MYH11(M4Eo)，與他人研究報道類似[7-8]。值得注意的是，本文入組的AML患者中有4例分子生物學檢發現異常，而相應染色體核型并未發現，據WHO分型標準[5]，我們將具有分子生物學異常的患者劃入相應染色體異常患者中做進一步研究。此外，本文還發現4例核型正常的AML(M2)患者檢出HOX11基因高表達，2例發現TLS/ERG融合基因陽性(染色體核型未檢出)。其原因可能為分子生物學敏感性較細胞遺傳學高，也可能與染色體分散度、染色體顯帶技術及分析經驗等因素有關[9]。因此，AML患者應該同時行全面的細胞遺傳學及分子生物學檢查，這樣可揚長避短，相互補充，進而提高AML的分層診斷和預后評估水平。

預后方面，有研究表明，患者性別，血小板數與AML臨床預后無明顯相關性[10]，但Klein等人發現性別及白細胞數對M2患者臨床預后相關[11]。本研究未發現性別，血小板數與臨床預后之間存在相關性。M2患者中，也未發現初診白細胞數對其臨床預后具有相關性。此外，AML患者有無貧血以及乳酸脫氫酶水平與臨床預后之間的相關性本文也未發現。

年齡是AML患者長期預后的獨立影響因素，老年AML患者獲得CR的概率以及中位生存期較年輕患者明顯低，其原因可能是老年患者體能狀態差，高危細胞遺傳學改變多見以及對化療藥物易產生耐藥所致[12-14]。本文的療效分析發現兒童組CR率最高，其次為成年組及老年組，其DFS和OS依次遞減。多因素分析結果顯示年齡是AML患者預后獨立的影響因素，兒童較成人和老年人OS長，但成人與兒童之間OS以及DFS并無差異，其原因可能系年輕AML患者發病常伴隨染色體結構易位以及融合基因的形成，而AML中常見的染色體易位及融合基因一般預示著較好的預后[15]。

研究顯示，染色體核型對AML預后起著重要預示作用[11,16]。染色體核型可分正常核型，染色體結構異常核型，染色體數目異常核型以及復雜核型，其中結構異常核型中t(8,21)以及inv(16)被歸入為預后良好核型，正常核型歸入預后中等組，復雜核型歸入預后不良組，而排除t(8,21)/inv(16)的數目異常及結構異常對預后的影響尚不明確[17]。為此本文研究了不同類型的核型對預后的影響，結果發現AML伴t(8,21)/inv(16)的OS以及DFS時間最長，其次依次為正常核型、染色體結構異常、復雜核型和染色體數目異常，分析結果顯示染色體數目異常為AML獨立的預后不良因素。

綜上所述，AML(非M3)患者預后受多種因素影響，其中，年齡是AML患者預后的獨立影響因素，年齡越小，預后越好；t(8,21)/inv(16)是獨立良好的預后因素，而染色體數目異常為獨立預后不良因素。因此，臨床上應早期聯合檢查患者細胞遺傳學以及分子生物學變化，并根據患者年齡、染色體核型、融合基因以及其他風險因素(有條件者，可檢測預后相關基因突變)對患者進行預后分層，依此對不同患者進行個體化治療，以延長患者長期生存時間，進一步提高生活質量。

[1]Fey M,Dreyling M.Acute myeloblastic leukemia in adult patients:ESMO clinical recommendations for diagnosis,treatment and follow-up[J].Ann Oncol,2009,20 (Suppl 4):100-101.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準 [M].3版.北京:科學出版社,2007:106-115.

[3]Lallemand-Breitenbach V,de Thé H.Retinoic acid plus arsenic trioxide,the ultimate panacea for acute promyelocytic leukemia? [J].Blood,2013,122(12):2008-2010.

[4]張前鵬，韓永勝，皖湘.急性未分化白血病 2 例并文獻復習[J].安徽醫藥,2016,20(2):350-351.

[5]DA Arber,Orazi A,Hasserjian R,et al.The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia[J].Blood,2016,127(20):2391-2405.

[6]Vardiman JW,Thiele J,Arber DA,et al.The 2008 revision of the World Health Organization(WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:rationale and important changes[J].Blood,2009，114(5):937-951.

[7]Li X1,Li X,Xie W,et al.Comprehensive profile of cytogenetics in 2308 Chinese children and adults with de novo acute myeloid leukemia[J].Blood Cells Mol Dis,2012，49(2):107-113.

[8]Ruiz-Delgado GJ,Macías-Gallardo J,Lutz-Presno J,et al.Core binding factor acute myeloid leukemia(CBF-AML) in Mexico:a single institution experience[J].Rev Invest Clin,2011，63(1):25-30.

[9]熊術道,胡林輝,蒲蓮芳，等.伴FUS/ERG融合基因急性白血病3例并文獻復習 [J].臨床薈萃,2015,30(10):1126-1129.

[10] Yang J,Yao DM,Ma JC,et al.The prognostic implication of SRSF2 mutations in Chinese patients with acute myeloid leukemia[J].Tumour Biol,2016,(Epub ahead of print).

[11] Klein K,Kaspers G,Harrison CJ,et al.Clinical impact of additional cytogenetic aberrations,cKIT and RAS mutations,and treatment elements in pediatric t(8;21)-AML:Results from an international retrospective study by the international Berlin-Frankfurt-Munster study group[J].J Clin Oncol,2015,33(36):4247-4258.

[12] Appelbaum FR,Gundacker H,Head DR,et al.Age and acute myeloid leukemia[J].Blood,2006,107(9):3481-3485.

[13] Nand S,Othus M,Godwin JE,et al.A phase 2 trial of azacitidine and gemtuzumab ozogamicin therapy in older patients with acute myeloid leukemia[J].Blood,2013,122(20):3432-3439.

[14] Achille NJ,Othus M,Phelan K,et al.Association between early promoter-specific DNA methylation changes and outcome in older acute myeloid leukemia patients[J].Leuk Res,2016,42:68-74.

[15] Grimwade D,Ivey A,Huntly BJ.Molecular landscape of acute myeloid leukemia in younger adults and its clinical relevance[J].Blood,2016,127(1):29-41.

[16] 張露露,夏海龍.急性髓系白血病預后相關因素分析[J].白血病·淋巴瘤,2015,24(2):105-110.

[17] Khaled S,Al Malki M,Marcucci G.Acute myeloid leukemia:Biologic,prognostic,and therapeutic insights[J].Oncology,2016,30(4):318-329.

Cytogenetics and molecular biology characteristics and prognosis of de novo non-M3acute myeloid leukemia

XIONG Shudao,HU Linhui,PU Lianfang,et al

(DepartmentofHematology/HematologicalLab,TheSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230601,China)

ObjectiveTo investigate the changes of cytogenetics and molecular biology in patients with de novo non-M3acute myeloid leukemia(AML),and to explore the related factors of prognosis for AML patients.MethodsNinety-nine cases of newly diagnosed de novo non-M3AML were enrolled in this study.The relationship between disease free survival(DFS),overall survival(OS) and clinical and laboratory data of all AML patients,including gender,age,WBC counts,PLT counts,Hb values,LDH level,chromosome karyotype and fusion gene were retrospectively analyzed.ResultsThe median age of 99 patients with AML in this study was 44(1～84) years old.The median follow-up was 12.6(0.33～59.47) months,the total complete remission(CR) rate was 62.7% and relapse incidence was 44.1%.CR rate was influenced by factors such as age(P=0.035).Univariate and multivariate analyses showed that the factors including age and numerical abnormalities of chromosomes were the independent unfavorable prognostic factors while t(8,21)/inv(16) was an independent favorite one for OS in patients with de novo non-M3AML.ConclusionsBoth elderly patients and changed chromosome numbers are the independent poor prognostic factors in patients with de novo non-M3AML,while t(8,21)/inv(16) is an independent favorite one.So the patients with de novo non-M3AML should be treated with individual therapy according to the prognostic prediction,which then may prolong the survival time and improve the quality of life.

Leukemia,myeloid,acute;Karyotype;Gene fusion;Risk factors;Prognosis

國家自然科學基金(81272259)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.032

2016-04-18，

2016-06-12)