SH-SY5Y神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因過表達對CaMKⅡ和CREB的影響

呂園園，　張淑麗，　吳昌學，　王曉玲，　官志忠，2，　齊曉嵐

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SH-SY5Y神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因過表達對CaMKⅡ和CREB的影響

呂園園1，張淑麗1，吳昌學1，王曉玲1，官志忠1，2，齊曉嵐1

目的研究SH-SY5Y神經細胞中α7 nAChR基因過表達對CaMKⅡ和CREB的影響。方法復蘇穩定轉染α7 nAChR-pcDNA3.1質粒及空載質粒的SH-SY5Y神經細胞后，用含G418的培養液進行篩選培養；應用實時熒光定量PCR法和蛋白印跡法(Western blot)檢測α7 nAChR基因過表達組、空載質粒組和正常對照組細胞中CaMKⅡ、CREB mRNA及蛋白表達水平的變化。結果與對照組相比，α7 nAChR基因過表達細胞組的CaMKⅡ、CREB mRNA表達水平分別增加了116.8%和114.7%(P<0.01)；及CaMKⅡ、CREB蛋白表達水平分別增加了8.7%(P>0.05)和41.4%(P<0.05)。結論α7 nAChR的神經保護作用可能與上調細胞CaMKⅡ、CREB水平有關。

α7 nAChR；SH-SY5Y細胞；CaMKⅡ；CREB

阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一種主要在老年人群中發生的神經元退行性變疾病，臨床特征以進行性癡呆為主，是導致老年人群殘疾和死亡的主要病因。臨床表現為漸進性的記憶障礙，認知能力衰退，智力和理解能力減弱，社會活動技能減退，最終失去自理能力。隨著社會人口的老齡化，AD的發病率在逐年上升，給社會和家庭帶來沉重的負擔。自1906年德國醫生Alois Alzheimer發現AD以來已經經歷了100多年，但其具體的發病機制目前還不十分清楚。AD的病因很多，涉及由遺傳、環境、代謝等因素相互影響致使的多種病理機制[1～3]。本課題組前期結果表明α7神經型尼古丁受體(Neuronal nicotinic receptor，nAChR)與大腦的學習記憶能力及認知能力有著密切的關系，能夠對抗Aβ沉積引起的神經毒性，具有一定的神經保護作用[4]，但其分子機制仍不十分清楚。α7nAChR是離子通道型受體，能通透Ca2+，而鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(Calmodulin-binding protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)和環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protein，CREB)是鈣信號轉導通路下游重要的信號分子，對學習記憶、認知能力及突觸可塑性有著重要的調節作用[5，6]。本文通過α7nAChR基因過表達對SH-SY5Y神經細胞中CaMKⅡ、CREB表達的影響來探究α7nAChR的神經保護作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

來源于人腦的SH-SY5Y神經細胞由本課題組保存；穩定轉染α7nAChR-pcDNA3.1質粒及空載質粒的SH-SY5Y神經細胞由本課題組凍存于液氮罐中；D-MEM培養液、雙抗購于HyClone公司；胰酶、血清購于Gibco公司；Revert Aid First Strandc DNA Synthesis Kit、Trizol試劑購于Thermo公司(美國)；CaMKⅡ、CREB及內參照β-actin的模板引物由上海生工合成；鼠抗CaMKⅡ單克隆抗體(sc-13141)、鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體及標記辣根過氧化物酶(HRP)的抗鼠二抗均購于Santa Cruz Biotechnology公司(美國)；兔抗CREB單克隆抗體(GTX61140)購于Gene Tex(美國)；標記HRP的抗兔二抗購于CST(美國)；G418、Real time-PCR所用試劑購于Roche公司(德國)。高效顯影膠片、聚乙烯二氟膜(PVDF)、ECL-Plus發光試劑均購于Amersham公司；顯影液及定影液購于柯達公司；普通化學試劑均購于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養SH-SY5Y神經細胞為貼壁細胞，完全培養基包含DMEM高糖培養基，胎牛血清10%，雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)1%；篩選培養基包含DMEM高糖培養基、胎牛血清15%、G418(濃度為0.8 mg/ml)；放于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測CaMKⅡ、CREB mRNA表達水平采用Trizol法提取SH-SY5Y細胞總RNA，再將RNA用PCR擴增逆轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。所用試劑為Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)。其中CaMKⅡ、CREB以及內參照β-actin的引物序列見表1。運用ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀收集待測基因及內參照β-actin擴增循環的熒光信號，以Applied Biosystems SDS 2.1軟件進行熒光收集和數據分析。SDS2.1軟件分析其△△Ct值和RQ(relative quantity)值(RQ=2-△△Ct)。以β-actin為內參照分析結果，并計算CaMKⅡ、CREB和對照組mRNA相對表達水平。實驗重復3次，每次3個復孔。

表1　待測基因的引物序列及擴增產物大小

1.2.3Westernblot檢測CaMKⅡ和CREB蛋白表達水平收集細胞，用裂解法提取細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。用Westernblot檢測CaMKⅡ、CREB蛋白表達水平，以β-actin作內參照。分析結果時用ImageJ軟件，計算CaMKⅡ、CREB蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度值的百分比作為蛋白表達水平。實驗重復3次，每次3個復孔。

2　結　果

2.1α7nAChR基因過表達對SH-SY5Y細胞CaMKⅡ、CREB mRNA表達水平的影響

SH-SY5Y細胞α7nAChR基因過表達后，細胞CaMKⅡ、CREB mRNA表達水平分別增高了116.8%(見圖1)及114.7%(見圖2)，與對照組細胞相比差異有統計學意義(P<0.01)。而空載對照組與對照組細胞相比不具有差異性。說明α7 nAChR基因過表達能增加CaMKⅡ、CREB mRNA水平的表達。

2.2α7 nAChR基因過表達對SH-SY5Y細胞CaMKⅡ、CREB蛋白表達水平的影響

SH-SY5Y神經細胞α7 nAChR基因過表達后，細胞CaMKⅡ、CREB蛋白表達水平分別增加了8.7%(見圖3A)及41.4%(見圖3B)，CaMKⅡ蛋白表達水平與對照組細胞相比差異無統計學意義(P>0.05)；CREB蛋白表達水平與對照組細胞相比差異有統計學意義(P<0.05)。說明α7 nAChR過表達能增加CREB蛋白水平的表達，而對CaMKⅡ蛋白水平的表達無顯著影響。

與對照組細胞相比差異有統計學意義**P<0.01

與對照組細胞相比差異有統計學意義**P<0.01

與對照組相比差異有統計學意義**P<0.05

3　討　論

nAChR是第2信使非依賴性、門控性離子通道型受體，可與神經遞質結合，本身也是離子通道，其開放不需要第2信使的參與。nAChR由2種亞基α和β組成，不同的亞基以不同的組合形式組成不同五聚體結構的尼古丁受體亞型，主要調控細胞內外Na+、K+和Ca2+等離子的流動[7]。在SH-SY5Y細胞中α7nAChR是主要的受體亞型之一，其減少與AD的發病有關。α7 nAChR可通過協助第二信使Ca2+參與調控神經系統興奮性、神經遞質釋放、長時程增強效應(long-termpotentiation，LTP)的誘導以及學習記憶能力。在AD患者中α7nAChR的激活也能改善患者的學習記憶能力以及注意力，是一類具有明確神經保護作用的受體[8]。Ca2+作為胞漿第二信使可通過α7 nAChR與CaM相結合形成Ca2+-CaM復合物，Ca2+-CaM作用于CaMKⅡ使其磷酸化而被激活，激活的CaMKⅡ(Phosphorylation of CaMKⅡ，pCaMKⅡ)作用于下游的信號分子[9]。在神經系統中，CaMKⅡ主要分布于海馬和大腦皮質的胞體、樹突及軸突中；而CaMKⅡ是海馬內突觸后致密物(Post-synapticdensity，PSD)的主要成分之一，影響突觸的發生及樹突、軸突的形成，從而調控神經遞質的釋放和突觸的改變，誘導LTP的產生，與學習和記憶功能有關[10～12]。CaMKⅡ是一種多功能絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，活化后的CaMKⅡ(pCaMKⅡ)與CaM的親和性增加，并使相關激酶轉為Ca2+/CaM非依賴形式，從而作用于突觸后膜上其他蛋白并使其磷酸化，最終形成LTP[13]。本研究結果表明α7 nAChR過表達能上調CaMKⅡmRNA，但對CaMKⅡ蛋白水平的表達影響不大，可能是因為α7 nAChR過表達使Ca2+內流增加，CaM相對增加，活化狀態的pCaMKⅡ增加而使CaMKⅡ相對減少；本實驗后期將對pCaMKⅡ進行研究。而CaMKⅡ作為Ca2+-CaM-CaMKⅡ信號轉導通路下游信號分子，在調節學習記憶和突觸可塑性中的作用是十分重要的。

CREB作為CaMKⅡ下游信號分子，在調節突觸可塑性中發揮顯著作用[14]。CREB是一種核轉錄因子蛋白，能使短時程記憶轉變為長時程記憶，促進形成長時程記憶及活化與長時程記憶相關蛋白的表達。而CREB的激活可促進與突觸可塑性相關因子的轉錄，從而誘導多種與學習記憶相關蛋白的產生[15]。本研究的結果表明α7 nAChR基因過表達可使CREB蛋白的表達水平增加，可能是α7 nAChR過表達促使鈣信號通路相關蛋白的表達，從而作用于下游的信號分子CREB，其蛋白水平的改變可影響神經遞質的傳遞和突觸的可塑性，從而影響學習記憶能力和認知功能。本實驗結果表明α7 nAChR基因過表達可通過影響CaMKⅡ、CREB的表達而影響學習記憶能力。這提示了激活α7 nAChR可能會緩解AD患者的學習認知能力，為臨床預防和治療AD提供一定的理論參考依據。

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Effects of α7 neuronal nicotinic receptor gene overexpression in SH-SY5Y cells on the levels of CaMKⅡand CREB

LVYuanyuan，ZHANGShuli，WUChangxue，etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China)

ObjectiveTo study the effects of α7 nAChR gene overexpression on the levels of CaMKⅡand CREB in SH-SY5Y cells. MethodSH-SY5Y cells were transfected with α7 nAChR-pcDNA3.1 plasmid，the stable clones were cultivated with culture medium containing G418.Real-time PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein levels of CaMKⅡand CREB，respectively；ResultsCompared to negative controls and controls，SH-SY5Y with α7 nAChR gene overexpression increased the mRNA levels of CaMKⅡand CREB by 116.8% and 114.7%，respectively；increased the protein levels of CaMKⅡand CREB by 8.7% and 41.4%，respectively. ConclusionNeuroprotective effect of α7 nAChR may be related to up-regulation of CaMKⅡand CREB levels.

α7 nAChR；SH-SY5Y cells；CaMKⅡ；CREB

1003-2754(2016)09-0772-04

2016-05-05；

2016-08-31

國家自然科學基金資助項目(81360178)，教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)，貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014[6008])，貴州省科技廳項目(201344，黔科合SY字[2013]3020)

(1.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

Q51；R749.1*6

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