UVB誘導(dǎo)HaCaT分泌細(xì)胞因子對(duì)HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護(hù)作用△

陳巧云，王業(yè)秋，祁永華，李建民，張寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

UVB誘導(dǎo)HaCaT分泌細(xì)胞因子對(duì)HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護(hù)作用△

陳巧云，王業(yè)秋，祁永華，李建民*，張寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討紫外線B波(UVB)誘導(dǎo)HaCaT分泌細(xì)胞因子通過(guò)旁分泌機(jī)制對(duì)HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護(hù)作用。方法將桃葉珊瑚苷作用于正常及光老化HaCaT細(xì)胞，ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α含量，并將各組培養(yǎng)液分別作用于HSF細(xì)胞，RT-PCR、Western-Blot檢測(cè)HSF細(xì)胞中MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果桃葉珊瑚苷對(duì)正常HaCaT細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α沒(méi)有顯著影響，而對(duì)光老化HaCaT分泌IL-6和TNF-α具有顯著的抑制作用(P<0.01)，光老化HaCaT培養(yǎng)液使HSF中MMP-1、MMP-3的mRNA和蛋白表達(dá)量升高，桃葉珊瑚苷處理組能夠明顯改善這種作用(P<0.01)。結(jié)論桃葉珊瑚苷通過(guò)減少炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌來(lái)拮抗UV對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，又可通過(guò)抑制旁分泌機(jī)制，保護(hù)成纖維細(xì)胞，抑制MMP-1、MMP-3的過(guò)表達(dá)，預(yù)防光老化。

桃葉珊瑚苷；HaCaT細(xì)胞；HSF細(xì)胞；光老化

紫外線B波(UVB)誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs，引起光老化[1-2]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1×10-5mol·L-1的桃葉珊瑚苷(aucubin，AU)通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的表達(dá)，拮抗UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，筆者研究桃葉珊瑚苷干預(yù)下的光老化角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液上清對(duì)成纖維細(xì)胞分泌MMPs的影響，進(jìn)一步解釋桃葉珊瑚苷抗光老化的作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 材料

人皮膚成纖維細(xì)胞HSF(上海艾研生物科技有限公司)，角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT(上海中橋新舟生物科技有限公司)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher公司)，桃葉珊瑚苷(成都曼思特生物科技有限公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、目的基因及內(nèi)參引物[生工生物工程(上海)有限公司]，人腫瘤壞死因子-α試劑盒、人白介素-6試劑盒(上海晶美生物科技有限公司)，目的蛋白一抗MMP-1、MMP-3、內(nèi)參β-actin、二抗(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱HF90型(上海智城分析儀器有限公司)，紫外線輻照計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器廠)，紫外線光療儀SS-01B型(Sigma公司)，PCR擴(kuò)增儀Tprofessional型(德國(guó)biometra公司)，電泳儀DYY-10C型(北京市六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)ChampGel 5000型、一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀smart chemill型(北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞的體外培養(yǎng)

HSF細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。

2.2 分組

2.2.1 HaCaT細(xì)胞分組 指數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)接種于6孔板，隨機(jī)分為正常對(duì)照組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，換不含藥DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；UV照射組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后參考文獻(xiàn)[3]方法以64 mJ·cm-2的UVB照射建立細(xì)胞光老化模型，添加正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；AU處理組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換含1×10-5mol·L-1桃葉珊瑚苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；UV+AU處理組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后以64 mJ·cm-2的UVB照射，用桃葉珊瑚苷終濃度為1×10-5mol·L-1的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。第48小時(shí)，取細(xì)胞和上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 HSF細(xì)胞分組 指數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板，24 h后，換2.2.1四組細(xì)胞上清液培養(yǎng)24 h。

2.3 ELISA法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α含量

HaCaT細(xì)胞給藥處理24 h后收集6孔板中各組細(xì)胞的上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-6、TNF-α的含量。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)HSF細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(dá)

指數(shù)生長(zhǎng)期HSF細(xì)胞按照2.2處理。第48小時(shí)，用TRIzol提取細(xì)胞的總RNA；用第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MMP-1引物F 5′- GGAAGGGCAAGGACTCTAT-3′、R 5′-CAGGGTTTC-AGCATCTGGT-3′，MMP-3引物F 5′-GCTGTGC-GTGGCAGTTTGC-3′、R 5′-AGCCTGGAGAATGTGA-GTGGAGT-3。50 μL反應(yīng)體系，95 ℃變性2 min，95 ℃變性30 s，52 ℃和58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)，將凝膠放入ChampGel 5000型凝膠成像系統(tǒng)攝像，與內(nèi)參OD值相比得各處理組的相對(duì)含量。

2.5 Western-Blot檢測(cè)HSF細(xì)胞中MMP-1、MMP-3的含量

HSF細(xì)胞按照2.2處理，棄去培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS液洗滌3次，置冰上加入WIP裂解液150 μL裂解，12 000 g低溫離心，取上清液，加上樣緩沖液，沸水煮5 min，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；TBST浸濕后室溫封閉2 h；一抗4 ℃孵育過(guò)夜；TBST震蕩洗滌4次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h；TBST震蕩洗滌4次，每次5 min；吸取多余TBST，將ECL發(fā)光液滴加在PVDF膜上，確保工作液覆蓋整張膜，吸去多余的工作液。將膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，曝光照相及圖像分析。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的影響

由表1可以看出，UVB照射后HaCat細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的量升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AU處理組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同處理對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的影響

注：與UV照射組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；下同。

3.2 不同處理對(duì)HSF細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)的影響

UV照射組與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AU處理組與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

注：1.正常對(duì)照組；2.UV照射組；3.AU處理組；4.UV+AU處理組。圖1 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNART-PCR產(chǎn)物電泳圖

表2 不同處理對(duì)HSF細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA相對(duì)含量的影響

3.3 對(duì)HSF細(xì)胞MMP-1、MMP-3蛋白表達(dá)的影響

由圖2和表3得出：UV照射后MMP-1、MMP-3蛋白表達(dá)量增加，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AU處理組與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，MMP-1、MMP-3蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

注：1.正常對(duì)照組；2.UV照射組；3.AU處理組；4.UV+AU處理組。圖2 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3 Western-Blot圖

表3 不同處理對(duì)HSF細(xì)胞MMP-1、MMP-3蛋白相對(duì)含量的影響

4 討論

UVB直接作用的靶部位為皮膚表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，刺激其分泌IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子等[4-5]。這些細(xì)胞因子可直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞本身，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，也可通過(guò)旁分泌機(jī)制作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPS，加速光老化[1]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明1×10-5mol·L-1的AU對(duì)UVB損傷的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證AU在此濃度下通過(guò)旁分泌機(jī)制對(duì)成纖維細(xì)胞的影響。UVB照射使HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α增多(P<0.01)，說(shuō)明此照射劑量造成了角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，1×10-5mol·L-1的AU處理后，HaCat細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的量與空白對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UVB照射HaCat細(xì)胞后加1×10-5mol·L-1的AU處理光損傷細(xì)胞，IL-6、TNF-α含量與UV照射組相比，分泌量明顯減少(P<0.01)，表明1×10-5mol·L-1的AU對(duì)正常HaCat細(xì)胞無(wú)明顯毒作用，但對(duì)UV損傷的HaCat細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用。

取上述4個(gè)處理組的培養(yǎng)液加到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞中，UV照射組MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白的表達(dá)量增多，與空白對(duì)照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，主要原因是因?yàn)閁V照射組培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α含量多，IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子通過(guò)細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體活化MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-1、MMP-3的表達(dá)[6]。1×10-5mol·L-1的AU處理組的上清液對(duì)HSF細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3的量與正常對(duì)照組相比無(wú)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明單純AU處理，對(duì)HSF細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3無(wú)顯著影響，UV+AU處理組的MMP-1、MMP-3與UV照射組相比，含量降低(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明AU通過(guò)減少HaCat細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的量，抑制MMP-1、MMP-3過(guò)表達(dá)。

綜上，桃葉珊瑚苷即可通過(guò)減少炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌來(lái)拮抗UV對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，又可通過(guò)抑制旁分泌機(jī)制，保護(hù)成纖維細(xì)胞，抑制MMP-1、MMP-3的過(guò)表達(dá)，預(yù)防光老化。

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InfluenceofHaCaTSecretionofCytokinesInducedbyUVBonHSFandProtectiveEffectofAucubin

CHENQiaoyun，WANGYeqiu，QIYonghua，LIJianmin*，ZHANGNing

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate UVB-induced HaCaT secretion cytokines and the protective effect of the aucubin on HSF through paracrine mechanisms.MethodsThe aucubin was used for normal and photoaging HaCaT cells，IL-6，TNF-α contents were detected by ELISA.The supernatant was applied to HSF cells，MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression was detected in RT-PCR and Western-Blot.ResultsAucubin had no significant effect on content of IL-6 and TNF-αsecreted by normal HaCaT cells，while photoaging HaCaT was significantly inhibited (P<0.01).Photoaging HaCaT medium increased MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression in HSF，aucubin treatment group could significantly inhibited this effect (P<0.01).ConclusionAucubin can protect keratinocytes by reducing the inflammatory cytokines IL-6，TNF-αsecreting，meanwhile inhibiting MMP-1，MMP-3 over expression by the paracrine mechanisms to protect fibroblast cells.

Aucubin；HaCaT cells；HSF cells；photoaging

2016-04-05)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274035)；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(PC13S15)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金(201309)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(2012)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院基金(2014)

*

李建民，教授，研究方向：中藥藥理；E-mail：ljm_1030@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.006