黃芩素在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS凋亡過程中對Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

宋江濤，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

黃芩素在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS凋亡過程中對Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

宋江濤，郭衛(wèi)春*

(武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

目的研究黃芩素在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的影響。方法采用RT-PCR檢測黃芩素作用前、后骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS中Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)變化情況，了解不同的黃芩素劑量和作用時間骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)變化，并計算Bcl-2/Bax比值。結(jié)果與骨肉瘤組相比，黃芩素作用組Bcl-2的mRNA表達(dá)隨著濃度增加和作用時間延長而遞減，Bax的mRNA表達(dá)隨著濃度增加和作用時間延長而遞增，Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)論黃芩素能通過下調(diào)Bcl-2的mRNA表達(dá)和上調(diào)Bax的mRNA表達(dá)而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

黃芩素；Bcl-2；Bax；凋亡；骨肉瘤

黃芩素是從唇形科植物黃芩中提取的主要活性成分之一，是一種有潛在應(yīng)用價值的抗癌新藥。目前有研究表明黃芩素可抑制肺癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[1-2]。但對其抗腫瘤機(jī)制的研究尚不深入，尤其對骨肉瘤的作用和相關(guān)機(jī)制研究甚少。已有研究證實(shí)黃芩素對骨肉瘤U2-OS細(xì)胞株有生長抑制作用，且促進(jìn)U2-OS細(xì)胞凋亡[3]。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度黃芩素處理骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，采用RT-PCR檢測黃芩素作用骨肉瘤細(xì)胞前、后細(xì)胞中Bcl-2和Bax表達(dá)的變化情況，探討B(tài)cl-2和Bax是否參與黃芩素誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的信號通路。

1 材料

骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS(上海中科院生物細(xì)胞庫)；DMEM高糖型培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；胰蛋白酶凍干粉(不含EDTA)(美國Sigma公司)；黃芩素(中國食品藥品檢定研究院)，將其溶于二甲基亞砜(DMSO)中制備成400 μmol·L-1的母液，培養(yǎng)基稀釋成工作濃度(用培養(yǎng)基稀釋后工作液DMSO濃度<0.1%)，-20 ℃儲存。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U2-OS細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖型培養(yǎng)液中，其中青、鏈霉素各100 U·mL-1，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。做細(xì)胞生長曲線，對數(shù)生長期處于細(xì)胞傳代后第3～5天，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。藥物濃度組用5個同底面積培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底面積90%以上終止培養(yǎng)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，分別加入用培養(yǎng)基稀釋藥物黃芩素25、50、100、200 μmol·L-1，以培養(yǎng)基作空白對照，分別作用24 h后終止培養(yǎng)；作用時間組用5個同底面積培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底面積90%以上終止培養(yǎng)，PBS洗滌2次后，加入用培養(yǎng)基稀釋藥物黃芩素50 μmol·L-1分別作用24、48、72 h終止培養(yǎng)，以培養(yǎng)基作空白對照。

2.2 總RNA提取和RT-PCR

將每1×107個細(xì)胞加1 mL的Trizol，三氯甲烷-異戊醇(24∶1)，異丙醇，抽提總RNA，70%的乙醇水溶液洗滌，RNA沉淀用DEPCRo溶解，紫外分光光度計測RNA含量。經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)合成cDNA后PCR擴(kuò)增。同時擴(kuò)增β-actin為內(nèi)參照，引物設(shè)計如下：bcl-2引物，上游5′-TTCGCCGAG-ATGTCCAGGC-3′，下游5′-TCACTTGTGGCCCAGAT-AGG-3′，擴(kuò)增片段387 bp。bax引物，上游5′-GAT-GCGTCCACCAAGAAG-3′，下游5′-GATCAGTTCC-GGCACCTT-3′，擴(kuò)增片段243 bp。內(nèi)參β-actin引 物：上游5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增片段540 bp。PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 1.5 min，其中后3步循環(huán)28次。反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液(5～10 μL)進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙啶染色，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 藥物濃度組中Bcl-2和Bax的表達(dá)情況

藥物濃度組顯示相同的作用時間隨著藥物濃度的增加，Bcl-2和Bax顯現(xiàn)出明顯的差異，順濃度梯度增大Bcl-2表達(dá)減弱、Bax表達(dá)增強(qiáng)，見圖1。

圖1 不同濃度黃芩素培養(yǎng)24 h對U2-OS細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

3.2 作用時間組中Bcl-2和Bax的表達(dá)情況

作用時間組顯示相同藥物濃度隨著作用時間的延長，Bcl-2表達(dá)遞減、Bax表達(dá)遞增，見圖2。

圖2 不同時間點(diǎn)25 μmol·L-1黃芩素對U2-OS細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

3.3 藥物濃度組和作用時間組中Bcl-2/Bax的變化情況

在藥物濃度組中，隨黃芩素藥物濃度增加，Bcl-2/Bax降低，見圖3。在作用時間組中，隨作用時間延長，Bcl-2/Bax降低，見圖4。

圖3 不同濃度黃芩素對U2-OS細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

圖4 不同時間對U2-OS細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

4 討論

細(xì)胞凋亡是生物體為調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動死亡的過程。細(xì)胞凋亡參與生物體中許多病理生理過程[4]，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是細(xì)胞增殖失控及凋亡抑制的結(jié)果。研究表明黃芩素具有抑制大多數(shù)腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[5]。而這種作用可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因進(jìn)行的。

Bcl-2基因家族是重要的凋亡調(diào)節(jié)基因，其中Bax基因促進(jìn)凋亡，Bcl-2基因抑制凋亡，Bcl-2家族成員通過相互競爭形成同型或異型二聚體，調(diào)控線粒體膜通透性從而雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[6]。因此Bcl-2/Bax的比值對細(xì)胞的存活起著重要作用。Bax與Bcl-2在細(xì)胞中的比例決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Bax過量時，形成Bax-Bax同二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2過量時，形成Bcl-2-Bax異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡[7]。以往的實(shí)驗(yàn)表明黃芩素對骨肉瘤U2-OS細(xì)胞株有生長抑制作用，且促進(jìn)U2-OS細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芩素可以在體外以劑量依賴和時間依賴方式誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時，我們發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bax在U2-OS未加藥組都有表達(dá)，且Bcl-2表達(dá)比bax較強(qiáng)；加入不同濃度黃芩素作用24 h后，隨著藥物濃度增加Bcl-2表達(dá)逐漸降低、Bax表達(dá)量逐漸增高；用50 μmol·L-1的黃芩素分別作用24、48、72 h，隨著作用時間增加Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，Bax的表達(dá)量逐漸增高。可知，Bcl-2和Bax這兩個凋亡調(diào)控基因參加了黃芩素誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS凋亡信號傳導(dǎo)通路。在不同藥物濃度組和不同作用時間組，bcl-2/bax隨藥物濃度的增加和作用時間的延長均降低，這可能促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞U2-OS的凋亡。

本研究證實(shí)黃芩素在一定范圍內(nèi)以劑量和時間依賴性的方式誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。這種凋亡可能是受到抑制凋亡基因bcl-2表達(dá)下調(diào)和促進(jìn)凋亡基因bax表達(dá)上調(diào)的調(diào)節(jié)，為其應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療提供了一定的依據(jù)。

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EffectofBaicalein-inducedApoptosisonExpressionofBcl-2andBaxinU2-OSCells

SONGJiangtao，GUOWeichun*

(DepartmentofOrthopedics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective：To investigate the expression change of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax in the induction of osteosarcoma cell line U2-OS apoptotic signal transduction with the effect of baicalein.MethodsRT-PCR was used to determine the mRNA expression of apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax，preand post administration of baicalein with different doses and length of time．ResultsCompared with the group of osteosarcoma，the expression of Bcl-2 was in inverse proportion to the concentration of baicaleinand its acting time，while the expression of Bax was in direct proportion to them．ConclusionBaicalein could induce the apoptosis of osteosarcoma cell line U2-OS via down-regulating of the expression of Bcl-2 and up-regulating of the expression of Bax．

Cerulenin；Bcl-2；Bax；apoptosis；osteosarcoma

2015-09-07)

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郭衛(wèi)春，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱外科與骨腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究；E-mail：guoweichun@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.007