短葶山麥冬細胞懸浮培養技術的初步研究△

萬學鋒，賴鐘雄，陳菁瑛

(1.福建省農業科學院 農業生物資源研究所 藥用植物研究中心，福建 福州 350003；2.福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.福建省漳州市農業科學研究所，福建 漳州 363005)

短葶山麥冬細胞懸浮培養技術的初步研究△

萬學鋒1，2，3，賴鐘雄2，陳菁瑛1*

(1.福建省農業科學院 農業生物資源研究所 藥用植物研究中心，福建 福州 350003；2.福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.福建省漳州市農業科學研究所，福建 漳州 363005)

短葶山麥冬莖尖誘導的愈傷組織為松散型顆粒狀，接種量為0.45 g達到最大增長量的時間短，四種碳源(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇)對短葶山麥冬懸浮細胞培養的影響差別不是很大，其中蔗糖的增殖率最高，達到252%，從成本上考慮，在以后的培養過程適合添加蔗糖作為碳源。短葶山麥冬懸浮細胞系的生長動態大致呈“S”形。短葶山麥冬懸浮細胞系培養選擇的時間為10 d。

短葶山麥冬；懸浮細胞培養；增殖

短葶山麥冬Liriopemuscari(Desne.) Bailey為百合科山麥冬屬植物，是《中華人民共和國藥典》1995年版新增品種山麥冬的原植物之一，其干燥塊根有養陰生津，潤肺清心功效[1]，有效成分麥冬多糖對增強免疫功能、保護腦缺血損傷、降血糖等具有重要的作用[2]。植物細胞懸浮培養(cell suspension culture)即單細胞群體或小的細胞聚集體在液體培養基中進行懸浮培養，它是從愈傷組織的液體培養的基礎上發展起來的一種培養技術[3]。培養物可以接種在培養瓶中在搖床上培養，也可以在生物反應器中進行大規模培養。這些細胞和小的聚集體來自愈傷組織、某個器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過物理或化學的方法進行分離而獲得[4-5]。對具有藥用價值的短葶山麥冬而言，進行細胞培養的研究對實現其藥用成分麥冬多糖的工廠化生產具有重要意義，因此，本試驗以短葶山麥冬莖尖誘導的愈傷組織[6]為起始材料，研究了短葶山麥冬懸浮培養體系建立與保持的關鍵因素，希望建立懸浮培養體系，以期為短葶山麥冬遺傳轉化合細胞突變體帥選提供優良的試驗體系。

1 材料與方法

1.1 材料

以短葶山麥冬莖尖誘導的愈傷組織離體保持系為起始材料(圖2A)

1.2 方法

1.2.1 懸浮培養體系的建立 挑選經過21 d愈傷組織培養，生長勢好，穩定性相對一致的愈傷組織置于20 mL MS+0.5 mg·L-12，4-D中，附加蔗糖20 g·L-1的液體培養基中，在25 ℃、110 r·min-1的條件下培養，并進行觀察。

1.2.2 接種量對懸浮培養的影響 選取已建立的細胞分散、生長旺盛的懸浮培養系，在MS+0.5 mg·L-12，4-D培養基中，比較不同接種量對懸浮細胞培養的影響。

1.2.3 碳源對懸浮培養體系的影響 選取已建立的細胞分散、生長旺盛的懸浮培養系，添加四種不同碳源(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇)的MS+0.5 mg·L-12，4-D培養基中，比較不同碳源對懸浮細胞培養的影響。

1.2.4 懸浮培養細胞系的生長 選取生長穩定，來源相同的懸浮培養細胞系，加入相同的液體培養基，每次移入材料采用5mL移液槍移入，比較不同碳源和接種量對短葶山麥冬懸浮培養細胞系的影響；在懸浮細胞培養中，以培養時間為橫坐標，懸浮培養物的鮮重為縱坐標，繪制懸浮細胞生長曲線。

1.3 培養條件

懸浮培養細胞于50 mL三角瓶中，置于普通搖床中，轉速12 h·d-1。試驗每處理重復三次，采用DPS v9.50數據處理系統，對樣本進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 接種量對懸浮細胞系生長的影響

短葶山麥冬莖尖誘導的愈傷組織為松散型顆粒狀，在轉入液體培養基后很快分散，其中有的顆粒較大，不利于直接作為細胞懸浮培養的最終材料。因此，在初步培養的過程中，需要通過懸浮培養來選擇剔除顆粒較大的細胞，經振蕩后選擇懸浮物上部細小的細胞繼代培養，21～28 d后可建立穩定的懸浮培養物。經過繼代培養后細胞能夠滿足懸浮培養的需要。

在MS+0.5 mg·L-12，4-D液體培養基15 mL上，每5 mL移液管里含有懸浮細胞約0.15 g，比較了不同接種量對短葶山麥冬懸浮細胞系生長的影響，見表1。

由表1可以看出，4個不同接種量對懸浮細胞培養生長表現為明顯的區別。接種量為0.15 g時，培養基的材料過少，增殖達到最大增長量時所需要的時間過長，這樣就勢必會給材料帶來培養細胞生活力下降；當接種量達到0.60 g時，所達到最大增長量時所需時間減少，但是培養基的營養元素不能滿足繼續增長的需求，限制了材料繼續增殖，容易形成大細胞團，造成材料出現污染；當接種量在0.30 g和0.45 g時，能夠滿足液體培養基生長的需求，所增殖的細胞也具有良好的生長勢，由于接種量為0.45 g所達到最大增長量的時間短，故選擇0.45 g來進行懸浮培養。

表1 不同接種量對短葶山麥冬懸浮培養細胞系生長的影響

注：達到最大密度時間以培養物鮮重不再增加時為準，生長量指達到最大密度時每個處理培養物的鮮重

2.2 不同碳源對短葶山麥冬懸浮培養細胞培養的影響

將不同碳源添加到懸浮細胞培養液中，培養20 d后，統計鮮重，比較不同的增殖率。結果見表2。

表2 不同碳源對短葶山麥冬懸浮培養細胞培養的影響

從表2中可出四種碳源對短葶山麥冬懸浮細胞培養的影響差別不是很大，其中蔗糖的增殖率最高，達到252%，高于其他三種碳源；添加甘露醇的增殖率最低，為202%。最高與最低的區別不算太大。從成本上考慮，在以后的培養過程適合添加蔗糖作為碳源，因為蔗糖的成本價最低。

2.3 短葶山麥冬懸浮細胞系生長曲線繪制

選取生長穩定、來源相同的懸浮培養細胞分為20瓶并進行編號，每隔2 d，共10個不同培養時期進行觀察統計。每個時期共有鮮重0.9 g，分別加入MS+0.5 mg·L-12，4-D液體培養基15 mL進行培養，從第3 d開始依次40目不銹鋼網濾去水分直接稱鮮重，繪制懸浮細胞系的生長，見圖1所示。

圖1 短葶山麥冬懸浮細胞系的生長曲線

圖1表明，短葶山麥冬懸浮細胞系的生長動態大致呈“S”形曲線。在2～6 d時生長緩慢，為延滯期，該時期細胞數目基本不增加(圖2B)；在6～14 d時，細胞生長迅速，其為對數期(圖2C、D)；14～20 d時，細胞數目有所增加，但隨著培養液的消耗，生長速度減慢，細胞生長受到抑制。因此短葶山麥冬懸浮細胞系培養選擇的時間為10 d(圖2E)。

A.愈傷組織；B.細胞懸浮培養前期；C-D.中期；E.后期；F.懸浮培養過程中細胞污染死亡圖2 短葶山麥冬懸浮培養體系

3 討論

3.1 短葶山麥冬懸浮細胞培養體系的建立和保持

對于懸浮培養物的建立，起始材料的選擇對試驗的繼續深入有著很關鍵的作用[7-8]，短葶山麥冬松散的愈傷組織是建立優質的細胞懸浮培養物的理想的起始材料。經懸浮培養數代后，即可建立優質的細胞懸浮培養物，從而提高生長勢。

在培養過程中，愈傷組織經多代(>8代)連續培養后，則出現衰退現象，生長勢能力下降。因此有待于探索出能夠獲得高產優質的細胞懸浮培養物的培養機制。

3.2 接種量對生長的影響

當初步探索短葶山麥冬懸浮培養接種量大小時，選取了三個不同的生長量。生物產量隨著接種量的增加而增大，但是隨著接種量倍數的增加，生物產量的生長速率卻反而下降。一般而言，加大接種量可提高生物產量，但是，由于一定量的培養液只能提供有限的營養成分，所以試驗中隨著接種量的增大，凈增生物量卻不一定增加。在懸浮培養過程中，要避免因為小細胞團形成大細胞團，這樣會增加污染的概率。

3.3 懸浮培養的利用

懸浮培養可以時培養物均勻、充分的接觸培養基，供給充足的養分，而且可以保持良好的通氣狀況，從而使培養物得到最大限度的生長。此外，液體懸浮培養具有接種量大、生長速率快、勞動強度小的特點，有利于組織細胞培養的規模化和工廠化。液體振蕩培養廣泛應用于細胞、原生質體、愈傷組織的培養及次生代謝產物的生產。短葶山麥冬懸浮培養在其他山麥冬離體培養中沒有涉及到，本研究是短葶山麥冬第一次的細胞懸浮培養，短葶山麥冬塊根具有藥用價值，在進一步的研究中可以探討，在懸浮培養環境條件下，探索次生代謝產物與懸浮培養的關系。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學工業出版社，1995：19-131.

[2] 林曉，周強峰，徐德生.麥冬藥理作用研究進展[J].上海中醫藥雜志，2004，38(6)：59-61.

[3] 高文遠，賈偉.藥用植物大規模組織培養[M].北京：化學工業出版社，2005.

[4] 俞長河，陳振光.荔枝胚性懸浮培養物的建立、保持和優化原生質體分離的研究[J].熱帶作物學報，1998，19(3)：16-20.

[5] 葉和春.水稻細胞懸浮培養及再生植株的研究[J].植物學報，1984,26(1)：52-59.

[6] 萬學鋒，黃穎楨，賴鐘雄，等.短葶山麥冬愈傷組織誘導與多糖積累動態研究[J].中藥材，2012，35(2)：171-175.

[7] 薛建平，石晶瑩.懷牛膝愈傷組織懸浮培養及其多糖含量的初步研究，中國中藥雜志，2008，33(21)：2467-2469.

[8] 胡海英，趙亞美，閻曉磊，等.香花槐愈傷組織的誘導與細胞懸浮培養技術[J].北京林業大學學報.2007，29(5)：26-30.

APreliminaryStudyofCellSuspensionsinLiriopemuscari(Desne.)Bailey

Wan Xuefeng1，2，3，LaiZhongxiong2，ChenJingying1*

(1.AgriculturalBio-resourcesInstitute，MedicinalPlantResearchCenterofFujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou350003，China；2.InstituteofHorticulturalBiotechnology，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，China；3.ZhangzhouinstituteofAgriculturalsciences，Zhangzhou363005，China)

The callus from stem was incompact，the inoculation amount of callus was 0.45 g.The difference among the four carbon sources (sucrose，glucose，mannitol and sorbitol) for suspension cell culture was not significant，sugar was the optimal carbon sources，and the highest growth rate was 252%，and sugar was the cheapest.The line of growth on suspension cells was approximately S-shaped.Suspension cultured cell needed 10 days to achieve the optimization.

Liriopemuscari(Desne.) Bailey；cell suspension culture；miacropropagation

2015-11-18)

福建省農科院藥用植物科技創新團隊建設項目(STIT-2-0351)

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陳菁瑛，研究員，研究方向：藥用植物資源與植物生物技術；E-mail：cjy6601@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.017