UPLC-MS/MS法同時測定安喘舒丸中腺苷和黃芪甲苷含量

華云鵬，雍太萍，宗寧峰，許桂麗，陸瑜

(解放軍第454醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210002)

UPLC-MS/MS法同時測定安喘舒丸中腺苷和黃芪甲苷含量

華云鵬，雍太萍，宗寧峰，許桂麗，陸瑜*

(解放軍第454醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210002)

目的建立同時測定安喘舒丸中腺苷、黃芪甲苷含量的方法。方法采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相等度洗脫，以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱為分析柱，通過電噴霧離子源，選擇正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測。結(jié)果腺苷、黃芪甲苷的線性范圍分別為10～320 ng·mL-1(r=0.996 8)、5～160 ng·mL-1(r=0.995 5)，加樣回收率在96.17%～99.48%，RSD均低于1.14%。結(jié)論該法專屬性強(qiáng)、快速靈敏，可用于安喘舒丸中腺苷、黃芪甲苷的含量測定。

安喘舒丸；腺苷；黃芪甲苷；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

安喘舒丸是解放軍第454醫(yī)院自行研制的臨床常用中藥制劑，由紫河車、黃芪等藥材組成，主要用于治療慢性支氣管炎并預(yù)防復(fù)發(fā)，療效顯著。黃芪具有補(bǔ)氣升陽、行滯通痹的功能，臨床用于治療中氣下陷、氣虛乏力[1-2]；紫河車具有溫腎補(bǔ)精、益氣養(yǎng)血的功能，臨床用于治療食少氣短，久咳虛喘[1]。

慢性支氣管炎是呼吸科較為常見的一種疾病，病因是患者非感染或感染因素而引發(fā)的支氣管黏膜、氣管及其周圍組織的非特異性的慢性炎癥[3-5]。有研究表明，紫河車中的腺苷和黃芪中的黃芪甲苷均有明顯的抗炎作用[6-9]。

為了控制安喘舒丸的質(zhì)量，研究建立一種安喘舒丸相關(guān)物質(zhì)快速、簡便、準(zhǔn)確的測定方法顯得尤為重要。本研究的主要目的是建立一種基于超聲波提取和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定安喘舒丸中腺苷和黃芪甲苷的快速簡便方法，旨在為安喘舒丸的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6430 LC-MS三重四級桿質(zhì)譜儀[配有電噴霧化離子源(ESI)]、色譜工作站(MassHunter)；AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；MICRO-17R冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；Drict-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司)。

1.2 試藥

安喘舒丸(中國人民解放軍第454醫(yī)院，批號分別為150601，150320，150805，150710，150920，150410)；對照品腺苷、黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110879-200202，110781-200613)；水為超純水；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測條件

Agilent ZOBAX SB C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75)；流速：200 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。離子源：ESI；離子化模式：正離子；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400 ℃；腺苷的Fragmentor及CE值分別為100、20 V；黃芪甲苷的Fragmentor及CE值分別為120、70 V；檢測對象：腺苷m/z268.1→m/z136；黃芪甲苷m/z808.2→m/z628.5。

2.2 對照品溶液的制備

分別取腺苷、黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇水溶液溶解定容，配置成腺苷(320 ng·mL-1)、黃芪甲苷(160 ng·mL-1)的混合對照品溶液。依次進(jìn)行倍比稀釋，結(jié)果見表1。

表1 化學(xué)對照品LC-MS分析濃度信息 /ng·mL-1

2.3 供試品溶液的制備

將安喘舒丸于40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎后過200目篩，精密稱取0.5 g干燥粉末，置于100 mL容量瓶中，加入90%甲醇水溶液定容，超聲處理30 min，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。按2.1項(xiàng)下條件下進(jìn)行測定，見圖1。

注：A.對照品；B.安喘舒丸；1.腺苷；2.黃芪甲苷。圖1 液-質(zhì)聯(lián)用離子流圖

2.4 線性關(guān)系

分別精密吸取2.2項(xiàng)下系列混合對照品溶液2 μL，按照2.1色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。腺苷回歸方程：Y=104 527X+12 258(r=0.996 8),定量下限為10 ng·mL-1;黃芪甲苷回歸方程：Y=46 826X+1366(r=0.999 5),定量下限為5 ng·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取低、中、高3個濃度(選取HB5、HB4、HB2)的混合對照品分別重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量2 μL，按2.1項(xiàng)下進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷的RSD分別為3.2%、3.4%、3.6%；黃芪甲苷的RSD分別為3.5%、2.1%、2.6%，表明該方法準(zhǔn)確性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(150601)樣品，分別于0、4、8、12、24 h按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。結(jié)果腺苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為3.1%、2.4%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批號樣品(150601)5份，按供試品溶液的制備方法操作依法測定。結(jié)果腺苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.9%、3.4%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品(批號：150601)約0.25 g，分別精密加入各對照品溶液適量，按2.3項(xiàng)下方法制備，依法測定，按下式計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定

取6批安喘舒丸，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣2 μL，并按2.1項(xiàng)下條件測定，計算各批安喘舒丸中腺苷、黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 安喘舒丸中2種化學(xué)成分含量測定結(jié)果 (n=6) /μg·g-1

3 討論

試驗(yàn)前期曾采用高效液相色譜法檢測安喘舒丸中的成分，但存在各成分相互干擾嚴(yán)重，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，某些成分含量低，無明顯的響應(yīng)信號，操作繁瑣、靈敏度低、分析速度慢、多成分含量同時測定色譜條件摸索困難等問題。

通過對不同規(guī)格的色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果采用Agilent ZOBAX SB C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)，所得色譜峰保留時間適中，峰形較好。試驗(yàn)中分別嘗試采用正、負(fù)2種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負(fù)離子模式。同時，考察了流動相的組成與比例對分析結(jié)果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)甲醇與0.1%甲酸水溶液的比例為25∶75時，2個化合物分離良好，彼此不會相互影響，且均在2 min內(nèi)出峰。

本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法同時測定安喘舒丸中腺苷、黃芪甲苷的含量，該方法具有干擾少、分析時間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，為科學(xué)控制安喘舒丸提供了可靠而簡單的方法，并擬定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)：腺苷含量不低于200 μg·g-1，黃芪甲苷含量不低于120 μg·g-1。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 王敏杰，金蓉，李慧芳，等.蒙古黃芪總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中南藥學(xué)，2015，13(2)：147-150.

[3] 彭淑芳.中醫(yī)辨證治療80例慢性支氣管炎的臨床研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8(3)：73-74.

[4] 陳曉紅.老年慢性支氣管炎42例治療體會[J].現(xiàn)代診斷與治療，2012，23(4)：333-334.

[5] 陳平.β2受體激動藥在慢性阻塞性肺疾病中應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中南藥學(xué)，2003，1(5)：293-295.

[6] 蔣激揚(yáng)，劉發(fā).腺苷的抗炎作用[J].中國藥理學(xué)通報，1998，14(S1)：79-82.

[7] 曹淑花，玄玲玲，王冬梅，等.腺苷衍生化合物WS070117M1對小鼠慢性阻塞性肺疾病的影響及其抗炎機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報，2015，50(8)：986-992.

[8] 王琳，閆晨.玉屏風(fēng)散中黃芪甲苷的制備及抗炎作用的研究[J].天津藥學(xué)，2007，19(1)：31-32.

[9] 朱燕輝，嚴(yán)奉祥.黃芪甲苷及其生物學(xué)活性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8(4)：781-783.

SimultaneousDeterminationofAstragalosideⅣandAdenosineinAnchuanshuPillbyUPLC-MS/MS

HUAYunpeng，YONGTaiping，ZONGNingfeng，XUGuili，LUYu*

(The454thHospitalofPLA，Nanjing210002，China)

Objective：To develop a UPLC-MS/MS method for the determination of adenosine and astragaloside Ⅳ in Anchuanshu Pill.MethodsIsocratic elution was carried out with mobile phase consisting of methanol-0.1% formic acid.The separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column，and the mass spectrometer was operated in the positive ionization electrospray (ESI) mode using multiple monitoring (MRM) for analysis of two components.ResultsAdenosine and astragaloside Ⅳ were all determined exactly，the linear ranges were 10-320 ng·mL-1(r=0.996 8)，5-160 ng·mL-1(r=0.995 5)，respectively.The recoveries of two analytes ranged from 96.17%-99.48% and the relative standard deviations were all below 1.14%.ConclusionA sensitive，accuracy and suitable UPLC-MS/MS method has been developed，and the method could be applied for the determination of adenosine and astragaloside Ⅳ in Anchuanshu Pill.

Anchuanshu Pill；adenosine；astragaloside Ⅳ；UPLC-MS/MS

2016-01-07)

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陸瑜，博士，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)；Tel：(025)80865133，E-mail：liuzixiu3221@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.026