早期蕈樣肉芽腫微小RNA表達譜的研究

王光平 倪娜娜 周曉偉 楊瑩 宋昊 溫斯健 陳浩 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所病理科

早期蕈樣肉芽腫微小RNA表達譜的研究

王光平 倪娜娜 周曉偉 楊瑩 宋昊 溫斯健 陳浩 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所病理科

目的篩選與早期蕈樣肉芽腫（MF）相關的微小RNA（miRNA）。方法用高通量miRNA PCR芯片檢測6例早期MF與6例濕疹和扁平苔蘚皮損中miRNA的表達差異。針對差異表達的miRNA，進行13例早期MF、13例濕疹和扁平苔蘚皮損組織及Myla細胞株的實時熒光定量PCR（RT?qPCR）驗證。結果芯片結果示，相對于對照組，早期MF hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p顯著高表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。皮損組織的RT?qPCR驗證結果與芯片結果一致。與正常人外周血T淋巴細胞相比，Myla細胞株中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107顯著上調，與芯片結果一致；未見hsa?miR?302c?3p的差異性表達。結論與炎癥性皮膚病相比，早期MF存在差異表達的miRNA表達譜。

微小RNAs；芯片分析技術；基因表達；蕈樣肉芽腫

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）發病機制尚不明確。經典的MF呈惰性進展，經過斑片期、斑塊期，最終發展為腫瘤期，生存期可長達數十年。微小RNA（miRNA）是22個核苷酸非編碼RNA，通過與靶信使RNA互補結合，導致mRNA降解或抑制蛋白質的翻譯過程，調控細胞的生長、發育、增殖、分化和凋亡等過程［1］。我們應用高通量miRNA PCR芯片技術，對6例早期MF的臨床標本進行檢測，篩選出顯著差異表達的miRNA，并進行臨床標本及CTCL細胞株的RT?qPCR驗證。

資料與方法

一、臨床資料

1.臨床標本：2014年11月至2015年11月，就診于中國醫學科學院皮膚病醫院皮膚科的早期MF及炎癥性皮膚?。詽裾罨虮馄教μ\）患者的皮損組織。根據表1的臨床、病理、免疫組化、基因重排4項中有≥2項，且得分總和≥4分，并排除淋巴結、血液、遠處轉移，診斷為早期MF［2］，相當于腫瘤淋巴結轉移（tumor nodemetastasis，TNM）分期中ⅠA～ⅡA期。對照組為臨床診斷為慢性濕疹或扁平苔蘚的患者，組織病理表現為以淋巴細胞浸潤為主的慢性皮炎或苔蘚樣皮炎。早期MF及濕疹、扁平苔蘚的診斷均由皮膚科醫生及病理科醫生共同確定。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

表1 早期蕈樣肉芽腫的診斷標準［2］

6例早期MF及6例炎癥性皮膚病的皮損組織用于miRNA PCR芯片檢測。6例早期MF患者均為男性，年齡26～62歲，平均43.5歲；TNM分期ⅠA期1例，ⅠB期5例。對照組慢性濕疹和扁平苔蘚各3例，男5例，女1例，年齡45～82歲，平均60.5歲。另取早期MF及對照組（濕疹、扁平苔蘚）的皮損組織各7例，加上芯片所用的標本兩組各13例用于RT?qPCR驗證。早期MF組，男10例，女3例，年齡13～80歲，平均43.2歲；TNM分期ⅠA期2例、ⅠB期9例、ⅡA期2例。對照組慢性濕疹7例，扁平苔蘚6例；男9例，女4例，年齡12～82歲，平均49歲。

2.細胞來源：Myla細胞株由北京協和醫院皮膚科惠贈。正常人淋巴細胞的制備：抽取健康志愿者外周血40m l，按照人外周血淋巴細胞分離液說明書分離外周血單個核細胞，再根據德國MiltenyiBiotec公司生產的CD3磁珠分選法獲得正常T淋巴細胞。

二、主要試劑

高通量miRNA PCR芯片檢測在上海啟因生物科技有限公司進行，相關試劑由該公司實驗室提供。hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?302c?3p、hsa?miR?107、U6引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；反轉錄試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Trizol（美國Invitrogen公司），SYBR green Master Mix（High ROX Premixed）（南京諾唯贊生物科技有限公司），人外周血淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），CD3磁珠（德國MiltenyiBiotec公司）。

三、方法

1.RNA提取及檢測：將皮損標本加入1 m l Trizol，置于-80℃冰箱儲存。研磨組織后，采用Trizol法提取組織總RNA，于分光光度計260、280 nm分別測定吸光度A值，檢測RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳測RNA純度及完整性。

2.高通量miRNA PCR芯片：用E.colipoly A為成熟的miRNA序列的3′端添加Poly A尾；反轉錄合成cDNA后進行熒光定量PCR（qPCR）。根據qPCR反應曲線得到各樣本目的基因和內參照Ct值（閾值循環數），采用△Ct進行相對定量?！鰿t=目的基因Ct值-同組內參照Ct值，將兩組樣品的△Ct相除為表達倍數（fold change，FC），再取2的對數即為log2FC，正值表示上調，負值表示下調。

3.RT?qPCR驗證：Trizol法分別提取新鮮皮損組織、Myla細胞、正常人外周血T淋巴細胞的總RNA。設計需驗證的miRNA及內參U6的引物（表2），反轉錄合成cDNA，再用SYBR green染料法進行RT?qPCR，反應程序：95℃3min預變性1個循環；95℃、30 s變性和62℃、40 s共40個循環，最后熔解曲線分析判定PCR反應的特異性?！鰿t=目的基因Ct值-同組內參Ct值，△△Ct=實驗組△Ct-對照組△Ct。以對照組目的基因表達量為1，2?△△Ct即為實驗組目的基因較對照組目的基因表達的倍數。

表2 miRNA引物序列

4.統計學方法：高通量miRNA PCR芯片用R語言，通過limma分析后進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。RT?PCR驗證的結果用Graphpad Prism統計軟件，兩組之間的差異比較采用Mann?Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、總RNA提取結果

各組總RNA的提取量2～30μg，平均9.6μg。A值1.72～2.04，平均1.96，說明總RNA的提取量足夠，蛋白和核酸的污染很少，總RNA的提取質量較高。變性瓊脂糖凝膠電泳檢測28S、18SRNA條帶比值≥1.5，表明RNA純度及完整性較好。

二、高通量miRNA PCR芯片結果

高通量miRNA芯片檢測結果見圖1。3個miRNA差異表達最顯著：hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達上調，早期MF組較對照組的表達差異log2FC分別為7.93、3.57、3.08，差異均有統計學意義（P值分別為0.019、0.046、0.029）。

三、組織標本的RT?qPCR驗證結果

溫度曲線、熔解曲線和電泳結果顯示，反應過程順利，特異性良好，沒有非特異性擴增，表明RT?qPCR結果可靠。驗證結果（表3）顯示，早期MF組較對照組hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達上調，與芯片結果一致，均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1高通量miRNA PCR芯片結果火山圖橫坐標為早期蕈樣肉芽腫組較對照組，每個miRNA表達倍數取2的對數（log2），值＜0，表達下調，越靠左，差異越顯著；橫坐標值＞0，表達上調，越靠右，差異越顯著?？v坐標為P值取-log10，越靠上，P值越小

表3 早期MF組和對照組組織標本中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對表達量（2?△△Ct，±s）

表3 早期MF組和對照組組織標本中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對表達量（2?△△Ct，±s）

注：MF：蕈樣肉芽腫。早期MF組和對照組各13例

組別早期MF組對照組P值hsa?miR?378a?5p 70.00±19.42 34.70±10.46 0.018 hsa?miR?107 14.09±5.90 2.48±0.80 0.004 hsa?miR?302c?3p 35.91±111.45 5.85±3.28 0.001

四、Myla細胞株的RT?qPCR驗證結果

溫度曲線、熔解曲線和電泳結果顯示，反應過程順利，特異性良好，沒有非特異性擴增，表明RT?qPCR結果可靠。經Mann?Whitney檢驗，與正常T淋巴細胞比較，Myla細胞株中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107顯著上調，與芯片結果一致（P＜0.05）；hsa?miR?302c?3p無差異性表達（P＞0.05）。見表4。

討論

miRNA是一類長22個核苷酸的非編碼小RNA，調控基因轉錄后的表達，并參與細胞分化、增殖、代謝及凋亡等幾乎所有生命活動。目前收錄在mirBase數據庫（http://mirbase.org/）中的人類前體miRNA有1 881種、成熟miRNA2 588種。MF的早期皮損表現多種多樣，易被誤診而延誤治療。研究發現，miRNA的功能失調對很多腫瘤的發生、發展、診斷及判斷預后起關鍵作用。

本研究用較新高通量miRNA PCR芯片，以良性淋巴細胞浸潤為主的炎癥性皮膚?。裾?、扁平苔蘚）為對照，hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p顯著高表達，相對差異倍數（log2FC）分別為7.93、3.57、3.08倍。進一步收集新鮮組織及MF細胞株Myla進行RT?qPCR驗證，證實了hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107均高表達，同芯片結果一致。而hsa?miR?302c?3p在MF組織中顯著高表達，在Myla細胞株中則差異無統計學意義。

2014年，Ralfkiaer等［3］用miRNA PCR芯片技術（含742個miRNA），以特應性皮炎皮損為對照，發現38個miRNA在T1期MF（斑片或斑塊占體表面積＜10%）中顯著差異性表達，而hsa?miR?302c上調表達的差異倍數最高；相對于T2期MF（斑片或斑塊占體表面積＞10%），36個miRNA在早期MF中顯著差異性表達，包含hsa?miR?107顯著性表達上調；相對于T3期（存在腫瘤性皮損）、T4期（紅皮病）MF和未定類原發性皮膚T細胞淋巴瘤，26個miRNA顯著差異性表達，其中包括hsa?miR?378顯著性表達上調。另有文獻證實hsa?miR?107在腫瘤期MF中表達上調［4］。本研究檢測結果表明，早期MF組織hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達上調。與國外文獻結果的差異，可能與人種差異和個體差異有關。

表4 Myla細胞株及正常T淋巴細胞中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對表達量（2?△△Ct，±s）

表4 Myla細胞株及正常T淋巴細胞中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對表達量（2?△△Ct，±s）

注：n=3

組別Myla細胞株正常T淋巴細胞P值hsa?miR?378a?5p 93.62±23.42 2.80±1.39 0.029 hsa?miR?107 15.41±5.97 1.10±0.68 0.029 hsa?miR?302c?3p 1.14±0.31 0.76±0.24 0.686

檢索國內外文獻，未檢索到上述3個差異表達的miRNA在MF發病機制中的研究文獻。Hsa?miR?378a?5p位于5號染色體，在惡性膠質瘤、鼻咽癌、非小細胞肺癌中具有一定的促癌作用［5?7］。Hsa?miR?107位于10號染色體，對肝癌、胃癌等可能具促癌作用［7?9］，對非小細胞肺癌、神經膠質瘤等具有預后價值［10?11］。Hsa?miR?302c?3p位于14號染色體，在生殖細胞癌、小細胞肺癌等高表達［12?13］。

該研究的不足之處在于病例數偏少、miRNA PCR芯片包含的檢測miRNA有限。本結果為miRNA在早期MF發病中的分子機制研究提供了線索，對篩選出的差異miRNA進行細胞和動物層面的生物學行為分析和功能研究將是今后要開展的工作。

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2017中國中西醫結合皮膚性病學術年會征文通知

經中國中西醫結合學會批準，中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會定于2017年4月20-24日在珠海維景國際大酒店召開中國中西醫結合皮膚性病學術年會。此次會議將發揚歷次年會的優良傳統，注重中西醫結合治療皮膚病的新方法及新的研究進展等方面的學術交流，內容密切聯系臨床，切合皮膚科醫師的實際需求，會議將邀請知名專家做特邀演講，闡述皮膚科相關領域的最新研究進展，創造形式多樣、內容充實、緊張熱烈、活躍互動的學術交流形式，達到全國皮膚科中醫、西醫、中西醫結合醫師共同展現才華、獲取知識和信息、增進友誼的目的，欲參加會議者請仔細閱讀通知并在規定的時間按要求投稿。

一、投稿要求：①投稿內容：皮膚科基礎研究論文、皮膚科臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內的中文摘要，請通過電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來稿請注明2017會議征文，截稿日期：2017年3月1日；③會議交流形式：特邀講演、大會發言、分會發言、書面交流。

二、聯系方式：上海市黃浦區成都北路500號峻嶺廣場19樓1908室，上海長征醫院《中國真菌學雜志》編輯部，郵編：200003，Email：pfkxh@126.com，聯系人：施慧，021-81885497，手機：13764560811。

M icroRNA expression profiles in earlym ycosis fungoides

Wang Guangping,NiNana,Zhou Xiaowei,Yang Ying,Song Hao,Wen Sijian,Chen Hao,Xu Xiulian,Sun Jianfang

Department of Pathology,Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com.cn;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

Objective To screenmicroRNAs（miRNAs）related to earlymycosis fungoides（MF）.Methods A high?throughputmiRNA PCR array was used to determinemiRNA expression profiles in skin lesions of 6 patients with early MF（early MF group）and 6 patients with lichen planus（control group）,followed by screening of differentially expressedmiRNAs between the two groups.Then,real?time fluorescence?based quantitative PCR（RT?qPCR）was performed to verify the differentially expressed miRNAs in lesional specimens from 13 patientswith early MF and 13 patientswith eczema or lichen planus,aswell as in Myla cells and normal human T?lymphocytes.Results The high?throughputmiRNA PCR array showed that the expressions ofhsa?miR?378a?5p,hsa?miR?107 and hsa?miR?302c?3p were significantly higher in the early MF group than in the control group（allP＜0.05）.For skin lesions,the results from RT?qPCR were similar to those from themiRNA array assay.Compared with normal human peripheral blood T?lymphocytes,Myla cells showed significantly increased expressions of hsa?miR?378a?5p and hsa?miR?107,which was consistentwith the results from themiRNA array assay.However,no significant differencewas observed in the expression of hsa?miR?302c?3p between the two kinds of cells.Conclusion MiRNA expression profiles in early MFare different from those in inflammatory skin diseases.

MicroRNAs;Microchip analyticalprocedures;Gene expression;Mycosis fungoides

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com.cn；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.06

國家自然科學基金（81272992）；江蘇省自然科學基金（BK2012505）；北京協和醫學院創新基金（2014?10023?1002?3010）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505）;Innovation Fund of Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union MedicalCollege（2014?10023?1002?3010）

2016?04?08）

（本文編輯：吳曉初）