高效液相色譜法測定枸櫞酸托法替布含量

●孫垚峰

高效液相色譜法測定枸櫞酸托法替布含量

●孫垚峰

目的：建立高效液相色譜法測定枸櫞酸托法替布含量。方法：以0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5）流動相A，以甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5）流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為250nm，柱溫40℃。結果：枸櫞酸托法替布在質量濃度為50-70ug/ml范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9995；平均回收率為99.9%。結論：該方法簡單、準確、無干擾，可用于枸櫞酸托法替布的含量測定。

高效液相色譜法；方法學驗證；枸櫞酸托法替布；含量測定

枸櫞酸托法替尼是美國輝瑞公司研發的一種新型Janus 激酶抑制劑，2012 年11 月經美國FDA 批準上市，商品名Xeljanz[1]。該藥用于對氨甲喋呤治療應答不充分或不耐受的中至重度活動性類風濕關節炎的成人患者，是一種新型口服JAK 抑制劑[2]。

本研究綜合相關文獻[3-5]。目前化學藥品含量的主要測定方法有，滴定法、比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。本文采用高效液相色譜法測定枸櫞酸托法替布的含量，該方法簡單、準確、無干擾，重復性好，可用于枸櫞酸托法替尼含量的控制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

2.3 專屬性實驗

取空白輔料、枸櫞酸托法替布片按照2.2.2方法配制輔料空白溶液、供試品溶液，先進空白溶液，再進供試品溶液，結果顯示無溶劑峰、輔料峰干擾測試。

試驗結果如下圖1所示：

2.4 線性及范圍

2.4.1 精密稱取枸櫞酸托法替布對照品，加溶劑溶解并稀釋制成每1ml約含枸櫞酸托法替布0.3mg的溶液，作為線性儲備液；精密量取線性儲備液 1.6ml、1.8ml、2.0ml、2.2ml、2.4ml分別置 10ml容量瓶中，加溶劑稀釋定容至刻度，搖勻，分別作為線性溶液①、②、③、④、⑤，包括80%規格、90%規格、100%規格、110%規格、120%規格，作為線

圖1

Thermo Ultimate3000型高效液相色譜儀；XP56梅特勒-托利多電子分析天平；實驗室專用超純水機。

枸櫞酸托法替尼（輝瑞公司；規格5mg★60片）；枸櫞酸托法替布對照品（120109-178146；中國生物制品檢定所）；乙腈、甲醇，色譜純（美國MERCK公司）；醋酸，分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 流動相：流動相A為0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈（60：35：5），流動相B為甲醇-0.1%醋酸溶液-乙腈（80：15：5），按下表進行梯度洗脫：

2.1.2溶劑：水-甲醇-乙腈（60:35:5）

2.1.3 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測波長為250nm，柱溫為40℃，流速為每分鐘1.0mL，自動進樣器5℃，進樣體積為10μl，理論板數按托法替布峰計應不低于3500；

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液：取枸櫞酸托法替布對照品約24mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取對照品儲備液5ml，置20ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中約含60ug的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：取枸櫞酸托法替布20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于枸櫞酸托法替布6mg），置100ml量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。性回歸點。以濃度（ug/ml）為橫坐標，托法替布峰面積的為縱坐標，得出線性方程線性方程，計算相關系數，結果見表1，線性回歸的相關系數（r）在≥0.999范圍內，證明方法線性良好（如圖2）。

表一

2.5 進樣精密度試驗

精密吸取2.2.2項下溶液，按2.1項下色譜條件，考察連續進樣6針對照品檢測結果的接近程度，結果托法替布峰面積RSD為0.1%，證明該方法重復性良好。

2.6 重復性試驗

取供試品，按2.2.2項下方法平行配制6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，結果枸櫞酸托法替布含量平均值（n=6）RSD為0.6%，證明該方法重復性良好。

試驗結果如下圖3所示：

2.7 準確度

以2.2.2中規定的樣品配制濃度為100%規格，分別準確稱枸櫞酸托法替布對照品，加空白輔料上適量，加溶劑使枸櫞酸托法替布溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，每個濃度（包括80%規格、100%規格、120%規格）各配制3份，共9份溶液。按含量測定方法，每份供試品溶液進樣1針，計算9份溶液枸櫞酸托法替布的回收率（n=9）RSD為0.5%，證明該方法回收率良好。

圖2 （線性及范圍）

圖3 （重復性試驗）

試驗結果如表2。

表2

2.8 耐用性試驗

改變柱溫、醋酸加入量以及改變色譜柱，供試品含量均在95.0%～105.0%之間，RSD分別為0.3%、0.2%、0.2%，正常條件與改變條件含量RSD為0.3%，證明該方法耐用性良好。

2.9 溶液穩定性試驗

2.9.1 對照品溶液 5℃條件下放置 0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分別進樣1針，記錄色譜圖。托法替布峰面積的RSD為0.2%。

2.9.2 供試品溶液在5℃條件下放置0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h后分別進樣1針，記錄色譜圖。含量在95.0%～105.0%之間，RSD為0.3%，證明該方法溶液穩定性較好。

3 結論

通過以上方法學實驗證明該方法簡單、準確、無干擾，可用于枸櫞酸托法替布的含量測定。

（作者單位：正大天晴藥業集團股份有限公司）

[1] 趙方露, 陳國華, 姚世倫等. 枸櫞酸托法替尼的合成[J]. 中國醫藥工業雜志,2014,45(3):201-204.

[2] 王鐵英. 托法替尼檸檬酸鹽( Tofacitinib) [J]. 中國藥物化學雜志，2013,23(2):166-167.

[3] 劉二東,宋春霞,劉冉冉等. 高效液相色譜法測定含乳飲料中苯甲酸的含量[J].化學工程師,2009,23 (4):29-30,48.

[4] 陳嬌婷,詹怡飛. HPLC法枸櫞酸托法替布的含量[J].中國民族民間醫藥，2015,24 (17):23-24.

[5] 王轉,尹東東,王杏林,詹璐璐. 高效液相色譜法在手型藥物分析中的研究進展[J].藥物分析雜質，2015,35(7):1127-1133.