一種新型火雞皰疹病毒細菌人工染色體的構建與鑒定

王志勝，劉　芳，許夢微，喬永峰，侯繼波，王繼春*

(1.江蘇省農業科學院/ 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014；2.南京農業大學動物醫學院，南京 210095；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

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一種新型火雞皰疹病毒細菌人工染色體的構建與鑒定

王志勝1，3，劉芳1，2，許夢微1，2，喬永峰1，3，侯繼波1，3，王繼春1，3*

(1.江蘇省農業科學院/ 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014；2.南京農業大學動物醫學院，南京 210095；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

擬構建一種新型火雞皰疹病毒(HVT)全基因組細菌人工染色體(BAC)，通過同源重組方法將mini-F載體插入HVT基因組的糖蛋白C(glycoprotein C，gC)基因的等位位點得到mini-F重組HVT，提取重組病毒的DNA轉入大腸桿菌DH10B細胞，再轉入GS1783細胞獲得BAC，拯救病毒獲得mini-F重組病毒和gC恢復病毒后，與親本病毒(HVT FC126)比較生長動力學和對雞馬立克病的免疫效力。結果：獲得數個BAC陽性克隆，取其中一個克隆(BACHVT-G)成功拯救出HVT mini-F重組病毒(HVTBAC-ΔgC)，并成功獲得了gC恢復毒株(HVTBAC-gC-R)。生長特性和免疫效力試驗表明HVTBAC-gC-R與HVT FC126無顯著差異，而HVTBAC-ΔgC增殖能力和免疫效力均明顯下降。成功構建了HVT全基因組的感染性BAC；HVT的gC基因是一個非必需基因，但對病毒的增殖能力和免疫效力有重要影響。

火雞皰疹病毒；細菌人工染色體；糖蛋白C；生長動力學；免疫效力

火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey，HVT)屬于甲型皰疹病毒亞科馬立克病毒屬，研究發現，在遺傳學和血清學上，HVT與馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)具有相關性[1]，且HVT對雞不致病，HVT FC126株被廣泛用于預防雞的馬立克病(Marek’s disease，MD)[2]。

HVT 病毒顆粒大小約為160 nm，核衣殼呈二十面體，HVT基因組為雙鏈 DNA，大小約為158 kb (GenBank：AF291866)[3]。HVT基因組大，有許多非必需基因和非編碼區，能夠容納大片段外源基因序列的插入；HVT對雞極為安全，不產生任何副反應；可以進行胚內接種或1日齡早期接種免疫；不但能避免母源抗體的干擾而且啟動免疫快；病毒接種雞后可以持續長達72周的病毒血癥[4-5]，因此，HVT是一種較理想的雞用活疫苗載體。目前，國外已成功應用HVT構建了多種病毒載體活疫苗，其中包括表達雞新城疫病毒(Newcastle disease，NDV)F抗原的HVT載體活疫苗，如Innovax?-ND-SB (MSD Animal Health)和Vectormune?HVT-NDV (Ceva)，還有表達雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)VP2抗原的HVT載體活疫苗，如 Vaxxitek?HVT+IBD (Merial) 和 Vectormune?HVT-IBD (Ceva)等，展現了HVT作為活疫苗載體的優良效果[6-12]。

構建皰疹病毒重組載體活疫苗的常用方法有同源重組或黏粒再生[13-14]，篩選方法通常是通過LacZ 或GFP標記等[15]。然而，HVT基因組大，又具有較強的細胞結合性，使其在真核細胞中同源重組時轉染效率較低，且重組毒株的篩選和純化困難重重，通常難于獲得完全純化的重組病毒，嚴重影響重組活載體疫苗的構建。黏粒再生是將病毒基因組分成幾個片段分別克隆后再通過共轉染進行病毒拯救，雖然可以在原核系統中進行基因改造，但操作過程繁瑣，病毒拯救效率低[13]。皰疹病毒的細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)及“enpassant”重組技術是近年來發展起來的一項新技術，能大大提高構建重組皰疹病毒的效率[16-18]。皰疹病毒BAC是將mini-F序列通過同源重組插入病毒基因組的非功能區或者非必需基因，再將含mini-F的重組病毒基因組導入大腸桿菌構建而成[19]。BAC可通過應用原核生物大量的基因操作工具進行基因改造，然后將重組子進行病毒拯救獲得重組病毒，這項技術能大大提高對病毒進行基因工程改造的效率，而且細菌人工染色體進行單拷貝或低拷貝復制，不易發生變異[20-21]。由B.Tischer 等建立的基于Red 重組系統的“enpassant”技術與BAC 技術結合，使同源重組直接由載體菌(E.coliGS1783)表達的Red 酶系統來完成，重組的效率得到了更大地提高[22]。目前已在馬立克病病毒和鴨瘟病毒等多個動物皰疹病毒株成功構建了BAC，大大加快了對相關病毒致病機制研究和活載體疫苗構建的步伐[21，23-25]。

已報道的HVT BAC的構建是將mini-F序列插入HVT基因組的US2區，雖然獲得了具有感染性的克隆，但是mini-F重組病毒很不穩定，有些重組毒在傳代后即失去增殖能力，而且從感染性克隆拯救獲得的病毒的生長特性也不一致，有些病毒的增殖能力大大減弱，這些結果表明將mini-F 插入US2位點可能對HVT的正常復制有干擾作用[15，26]。本研究將mini-F 序列插入HVT基因組的gC基因位點，并替換敲除gC基因，以獲得穩定的HVT BAC，為HVT活載體疫苗的構建和改進提供可靠的技術平臺。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒與細菌Mini-F質粒和GS1783菌株由柏林自由大學病毒研究所Nikolaus Osterriender教授惠贈，GS1783菌株的感受態細胞由本室自制。DH10B感受態細胞購自Invitrogen公司。Plasmid Mini Kit 和 Midi Kit購自 QIAGEN 公司。

1.1.2病毒與細胞HVT FC126病毒株來自中國獸醫藥品監察所(CVCC AV19)，制備雞胚成纖維細胞的SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。馬立克病病毒京-1株強毒株(CVCC AV86)來自中國獸醫藥品監察所，系由本室擴繁的全血病毒，液氮保存。

1.1.3生化試劑等限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、SmaⅠ、ScaⅠ、BamHⅠ和PacⅠ及 ExTaqDNA 聚合酶均購自TaKaRa公司；DMEM培養基、胰酶及新生牛血清購自Sigma 公司；其他試劑均購自南京生工生物有限公司。

1.1.4實驗動物SPF雞是用購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司的SPF雞胚在本單位孵化而得，試驗雞飼養于隔離環境中。

1.1.5PCR引物根據HVT FC126 株全長基因組序列(GenBank：AF291866)，應用Vector NTI軟件設計gC基因上、下游同源臂擴增的PCR引物和擴增含gC基因片段序列的PCR引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1PCR引物

Table 1PCR primers

引物Primers引物序列(下劃線為添加的酶切位點)Primersequences(restrictionsitesareunderlined)HVT-BH1F5'-GTAGAATTCCAGTGTATGTTCCTTAGTGT-3'(EcoRⅠ)HVT-BH1R5'-ATCCCGGGCTTTAATTAAGTTTCGATAGATGCGTAATA-3'(SmaⅠ、PacⅠ)HVT-BH2F5'-CGGGATCCAGTTAATTAAATCAGCACCATCGCATTG-3'(BamHⅠ、PacⅠ)HVT-BH2R5-GACAAGCTTGAAATGTCTATGGTGTGATTGGA-3'(HindⅢ)HVT-gCF5'-TCGCCATGTGCGCCACTAGCAT-3'HVT-gCR5'-AACACACACAAGACGCGAGGGCTC-3'

1.2方法

1.2.1轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構建及酶切驗證參照文獻所述方法[21]，提取HVT FC126基因組DNA作為模板，應用特異性引物(表1)，通過PCR反應擴增gC基因的上游同源臂H1和下游同源臂H2，再通過酶切連接將H1和H2先后連接到基礎載體質粒pUC19上獲得pUC19(HVT)-H1-H2；然后，再將mini-F酶切插入到pUC19(HVT)-H1-H2同源臂H1和H2之間的PacⅠ酶切位點處，獲得gC位點的轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF。連接好的載體通過應用ScaⅠ和EcoRⅠ進行酶切鑒定，應用Vector NTI軟件預測酶切后的片段應分別為10 165與3 775 bp大小的2條和7 507、5 095與1 338 bp的3條條帶(圖1A)。

1.2.2轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF和HVT DNA共轉染CEF根據文獻描述的方法[21]，首先提取感染HVT后48～72 h細胞中病毒的DNA，取約1 μg HVT DNA與5～10 μg轉移載體質粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的DNA采用磷酸鈣沉淀法共轉染原代雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)。轉染細胞傳代培養，在波長為488 nm紫外光下觀察，當出現發出綠色熒光的細胞病變蝕斑時，挑取綠色蝕斑傳到新鮮制備的單層CEF上培養擴增重組病毒。

1.2.3Mini-F重組病毒HVT與親本病毒HVT的分離與純化Mini-F重組HVT經連續數次挑取綠斑再接種于6孔板CEF內純化和擴繁后，收集6孔板內的細胞毒采取超聲波裂解進行細胞破碎，破碎細胞病毒液10倍倍比稀釋接種96孔新鮮制備的CEF平板上，篩選單孔出現單個綠斑的重組病毒，經再次接入CEF進行擴繁，同時加GPT進行加壓培養，即接入前1 h細胞培養液換成GPT加壓篩選培養液(含10%血清、1% S/P，350 μg·mL-1霉酚酸、80 μg·mL-1黃嘌呤和100 μg·mL-1次黃嘌呤的DMEM)，每24 h換一次加壓篩選培養液，以獲得純化的mini-F重組HVT。

1.2.4mini-F重組HVT DNA的轉化及其篩選驗證根據文獻描述的方法[21]，提取mini-F重組HVT細胞毒DNA，取約5 μg加到50 μL電轉化感受態細胞E.coliDH10B中。輕輕混勻，冰浴 5 min 左右，吸入到規格為 0.1 cm經預冷的電轉化杯中，應用美國哈佛儀器公司 ECM630 電轉儀，電轉化條件為 1 500 V、200 Ω、25 μF，電擊完成后，加入到32 ℃預熱的SOC培養基中，32 ℃、220 r· min-1振蕩活化1 h，500 g 離心5 min，取細菌沉淀用150 μL LB重懸后均勻涂布于含30 μg·mL-1氯霉素的LB瓊脂平板上，32 ℃培養48 h 以上。然后，挑取陽性BAC克隆單菌落接種于含有 30 μg·mL-1氯霉素的LB培養液中，32 ℃振蕩培養過夜，提取DNA，應用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ進行RFLP鑒定，將酶切圖譜與應用Invitrogen軟件預測的HVT FC126株的圖譜進行對比分析。經鑒定正確后，再以上述相同方法將DNA通過電轉化導入自制的E.coliGS1783中，再次挑取陽性BAC克隆后，采用Qiagen plasmid Midi Kit提取BAC質粒DNA后進行RFLP鑒定。

1.2.5HVT BAC的病毒拯救和gC恢復毒株的獲得HVT BAC的病毒拯救參照文獻方法進行[21]，采用Qiagen plasmid Midi kit 按照說明書提取HVT BAC的 DNA，取約500 ng DNA按上述相同的磷酸鈣沉淀法轉染新鮮制備的單層CEF。次日將培養液換成含10%胎牛血清的培養液，培養48～72 h后用胰酶將細胞消化成單個細胞，傳代到新鮮制備的CEF細胞平板板上，繼續培養48～72 h后，在波長為488 nm紫外光激發下觀察發出綠色熒光的病毒蝕斑。

gC恢復病毒的獲得：應用HVT-B H1 F和HVT-B H2 R為引物，以HVT DNA為模板，PCR擴增帶有上、下游同源臂和gC基因的DNA片段，取此DNA片段2～3 μg與約500 ng HVT BAC的DNA共轉染CEF，轉染后96 h取感染細胞接種到新鮮制備的單層 CEF上培養，24～48 h 后，用甲基纖維素培養基覆蓋，觀察在紫外光激發下不發出綠色熒光的病變蝕斑 (白斑)，挑取白斑接種到新的CEF，如此重復多個循環直至純化成功。提取純化病毒 DNA為模板，用一對引物HVT-gC F和HVT-gC R(表1)進行PCR擴增，并對擴增片段進行序列測定，驗證gC是否恢復成功。

1.2.6親本毒株、BAC拯救毒株和gC恢復毒株體外生長特性的測定與比較病毒體外生長特性參照文獻所述方法進行[21，26]，將病毒按0.01 感染復數(multiplicity of infection，MOI)分別接種到生長24 h的單層原代CEF上培養。測定接種前和接種后6、12、24、36、48和72 h感染細胞經胰酶消化成單個細胞的病毒滴度。收集病毒時，首先去除細胞上清液，經PBS洗滌3次，用0.1%胰酶消化后再用2 mL DMEM 重懸細胞。對單個細胞的病毒滴度，取100 μL細胞懸液10倍倍比系列稀釋至10-7，接種到新鮮制備的單層CEF上，培養72 h后計數蝕斑形成單位(plaque forming unit，PFU)。對細胞結合性病毒的滴度，將重懸細胞離心后，傾去上清，將沉淀用SPGA再次重懸后，經50 Hz 5 min超聲裂解后接種CEF測定滴度，試驗共重復3次，根據PFU計數結果繪制病毒生長曲線。

1.2.7親本毒株、BAC拯救毒株和gC恢復毒株對MD保護性試驗的比較將3種病毒分別以4 000 PFU接種1日齡SPF雛雞20只，于接種后21 d，與對照雞20只，腹腔注射馬立克病病毒京-1株強毒株(CVCC AV86)0.2 mL，觀察2個月，對病死雞和存活雞剖檢觀察病變，出現坐骨神經、臂神經叢等腫大，肝、腎、心、性腺、肺等臟器出現淋巴瘤的病理變化則判為馬立克病陽性，按文獻所述方法統計馬立克病發病比例[15，26]，比較3種病毒對MD的免疫保護效力。

2　結　果

2.1轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構建及其驗證

通過特異性引物PCR擴增獲得HVT FC126 gC上下同源臂并成功連接到pUC19載體質粒上獲得pUC19(HVT)-H1-H2；然后將mini-F序列連接到pUC19(HVT)-H1-H2質粒上獲得轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-mini-F(圖1A)。通過EcoR Ⅰ和ScaⅠ酶切驗證符合理論預測結果(圖1B)。

A.轉移載體質粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF(13 940 bp)結構；B.轉移載體質粒pUC19-H1-H2-miniF酶切驗證圖譜：其中泳道1為 限制性內切酶ScaⅠ酶切結果，條帶大小分別為10 165、3 775 bp；泳道2為限制性內切酶EcoRⅠ酶切結果，條帶大小分別為7 507、5 095、1 338 bp；泳道3為未酶切的pUC19(HVT)-H1-H2-miniF質粒DNA對照；M.15 000 bp DNA相對分子質量標準A.Predicted map of transferring vector pUC19(HVT)-H1-H2-miniF(13 940 bp)；B.Gel map of pUC19(HVT)-H1-H2-miniF with restriction digestion：Lane 1 show fragments of 10 165 bp and 3 775 bp after digestion with ScaⅠ；Lane 2 show fragments of 7 507 bp，5 095 bp and 1 338 bp after digestion with EcoRⅠ；Lane 3 show the DNA of pUC19(HVT)-H1-H2-miniF without digestion；M.15 000 bp DNA marker圖1　轉移載體質粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構建與鑒定Fig.1　Construction and identification of transferring vector pUC19-H1-H2-miniF

2.2Mini-F重組HVT的獲得與純化

轉移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF和HVT病毒DNA共轉染原代CEF后72 h盲傳一代后再培養72 h后在紫外光激發下觀察到發出綠色熒光的蝕斑(圖2)，連續2次挑取綠斑接種于6孔板CEF擴繁后，收集6孔板內的細胞毒采取超聲波裂解進行細胞破碎，破碎細胞病毒液倍比稀釋接種96孔新鮮制備的CEF平板上，篩選5個單孔出現單個綠斑的重組毒株，消化傳代接入CEF擴繁，經過3輪GPT加壓篩選后可見所有蝕斑在熒光顯微鏡下都發綠光，成功獲得了含mini-F 的HVT重組病毒。

A.波長為488 nm紫外光下觀察到的發出綠色熒光的病毒蝕斑；B.在白光下觀察到的蝕斑A.Green plaques observed under UV excitation of 488 nm wavelength；B.Plaques of phase control圖2　Mini-F重組HVT病毒蝕斑Fig.2　Plaque formation by mini-F recombinant HVT

2.3HVT BAC陽性克隆的獲得與驗證

取提純的 mini-F重組HVT的DNA電轉化到E.coilDH10B 感受態細胞中，獲得10個克隆(C1～C10)，取其中一個克隆(BACHVT-C1)，用堿裂解法提取BACHVT-C1質粒DNA后用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，進行RFLP分析，結果表明，酶切圖譜是典型的BAC譜型，條帶分布與軟件分析結果基本吻合，但并不完全一致，這可能是由于本研究中所用HVT FC126株與參考序列毒株的來源不同，其基因組序列不完全相同所致(圖3)。然后，再提取BACHVT-C1的DNA電轉化自制的E.coliGS1783感受態細胞，獲得了15個陽性克隆，取其中一個命名為BACHVT-G，經RFLP驗證與BACHVT-C1完全一致，表明成功獲得了HVT FC126株的細菌人工染色體。

圖3　BACHVT-C1 DNA RFLP圖譜Fig.3　RFLP map of BACHVT-C1

2.4HVT BAC的病毒拯救及gC恢復毒株的獲得

將BACHVT-G的DNA轉染CEF后，72 h傳代一次，再培養48 h后，在波長為488 nm紫外光激發下觀察到發出綠色熒光的病毒蝕斑，挑取其中一個蝕斑，進行純化，獲得了HVT BAC拯救的重組毒株，命名為HVTBAC-ΔgC。

以HVT DNA為模板，用引物HVT-B H1 F和HVT-B H2 R 進行PCR擴增，獲得含有兩側同源臂和gC基因的片段，將此片段DNA與BACHVT-G的 DNA共轉染到CEF，轉染96 h后盲傳1代，繼續培養48 h后，在波長為488 nm紫外光激發下觀察到不發出綠色熒光的病毒蝕斑，經數輪挑斑純化獲得一株純化病毒，命名為HVTBAC-gC-R，分別以HVTBAC-ΔgC、HVTBAC-gC-R和HVT FC126株的DNA為模板，用一對引物(HVT-gC F和HVT-gC R)進行PCR擴增，其中HVTBAC-gC-R和HVT FC126株均擴增出1 600～1 700 bp大小的片段，而HVTBAC-gC-R未擴增出條帶 (圖4)，所擴增出的片段經序列測定證明與HVT FC-126株gC基因序列完全一致，表明gC基因成功恢復。

圖4　HVT gC片段的PCR條帶Fig.4　PCR fragments of HVT gC sequences

2.5HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R生長特性的比較

測定和比較了HVT FC126、HVTBAC-ΔgC、HVTBAC-gC-R感染 CEF的多步生長動力學，結果顯示HVT和HVT BACΔgCR接種 CEF后，無論是經胰酶消化成單個細胞的病毒滴度(圖5A)，還是經裂解的細胞結合性病毒的滴度(圖5B),兩株病毒的滴度都無顯著差異。而gC缺失株HVTBAC-ΔgC病毒滴度明顯下降，其經胰酶消化成單個細胞的病毒滴度了下降了約3倍，而經裂解的細胞結合性病毒的滴度則下降了約100倍。表明HVT的gC基因雖然不是一個必需基因，但對病毒的增殖有重要作用。

2.6HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R對MD保護效力的比較

空白對照組雞均健康，無馬立克病病變。3種HVT病毒接種1日齡雛雞后未出現任何不良反應。攻毒后剖檢病死雞和存活雞觀察馬立克病的典型病變，結果表明，攻毒對照組85%(17/20)MD陽性，HVT和HVTBAC-gC-R免疫組的MD陽性率分別為15%(3/20)和10%(2/20)，MD的陽性率分別減少了70%和75%，達到了免疫保護合格的標準，表明作者所構建的HVT BAC是HVT全基因組克隆，可以應用于重組載體活疫苗的構建。而HVTBACΔgC免疫組的MD陽性率為35%(7/20)，較攻毒對照組僅減少了50%(表2)，不能達到合格的標準，表明gC基因缺失后對HVT的免疫原性產生較大影響。

A.經胰酶消化成單個細胞的病毒滴度；B.經裂解的細胞結合性病毒的滴度A.Titers of trypsinized single cells after infection；B.Titer of cell-associated viruses released from infection cells圖5　HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R在CEF上的生長動力學曲線Fig.5　Growth kinetics of HVT FC126,HVTBAC-ΔgC and HVTBAC-gC-R on CEF

表2MDV強毒株攻擊保護率

Table 2Protection against virulent MDV challenge

組別Groups攻毒數/只Numberofchallenge發病數/只NumbershowedclinicalsignsMD陽性率/%PositiverateofMDMD保護率/%ProtectionrateagainstMDHVT2031585HVTBACΔgC2073565HVTBAC-gC-R2021090攻毒對照Challengecontrol201785/空白對照Negativecontrol2000/

3　討　論

火雞皰疹病毒被廣泛用于雞馬立克病的預防，HVT的基因組較大，有多個非必需基因和非編碼區序列，能夠容納大片段外源基因的插入[27]，因此，被成功用作禽類疫病重組病毒活載體疫苗的載體。早在20世紀90年代以來，國外研究者就已經開始用HVT為載體表達NDV的 F蛋白、IBDV的 VP2蛋白和禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的HA和NA蛋白等外源抗原，顯示了優良的保護效果[12，28-30]。國內不少研究者也開展了HVT活載體相關方面的研究，通常采用傳統的同源重組方法插入外源基因，然后選用LacZ或GFP作為遺傳標記基因，采用有限稀釋法和蝕斑挑斑以純化重組毒株，結果表明采用這種傳統的方法，難于獲得真正純化的HVT重組病毒，這可能與HVT有較強的細胞結合性有關。自M.Messerle等報道成功構建首個鼠巨細胞病毒(mouse cytomegalovirus，MCMV)全基因組的細菌人工染色體以來[19]，越來越多的皰疹病毒相繼構建成功細菌人工染色體(BAC)感染性克隆，BAC技術實現了在大腸桿菌內進行皰疹病毒基因組的修飾，尤其是Red/ET克隆修飾系統和Cre/loxP 克隆修飾系統在BAC 遺傳修飾上的廣泛應用，使得對BAC 分子克隆化病毒基因組上任何位點的插入、缺失、替換和點突變等遺傳修飾變得非常簡便、快速和準確，大大提高了相關病毒致病機制和病毒活載體研究的進展[16]。

構建HVT全基因組感染性細菌人工染色體成功的關鍵有以下幾個方面：第一，篩選標記基因的選擇。本課題組在篩選標記上曾使用過EGFP作為標記基因，但在重組病毒的純化上遇到了很大的困難，因為HVT具有一定的細胞結合特性，因而在重組病毒挑斑純化過程中，完全去除野毒株非常困難。本研究中最終使用了mini-F載體中的Eco-gpt作為HVT重組病毒的篩選基因，在鳥嘌呤從頭合成途徑中，催化IMP到XMP反應的是IMP脫氫酶，而MPA是該酶的不可逆阻斷劑，在恰當濃度的MPA存在下，鳥嘌呤只能通過替代途徑，在補充適當濃度的黃嘌呤和GPT的參與下合成，動物細胞本身不能合成GPT，但重組的病毒可以提供GPT從而使病毒完成核酸代謝，而野毒株感染細胞則不能進行核酸代謝，經過幾輪加壓篩選后，在顯微鏡下已觀察不到野毒株感染細胞，大大提高了重組病毒的純化程度。第二，mini-F載體的插入位點也是構建穩定的HVT BAC的關鍵之一，本研究也曾在US2位點插入mini-F 載體序列，但獲得的重組病毒很不穩定，隨著純化過程中傳代次數的增加，重組病毒的復制能力明顯變弱(未報道)。而在將mini-F載體插入gC等位位點后獲得的重組病毒則很穩定，才能保證傳代純化的正常進行。第三，在mini-F重組HVT純化的過程中，除挑斑純化之外，還將擴繁的含重組病毒和親本病毒的混合樣品經超聲波裂解釋放出游離狀態的病毒，再經倍比稀釋后接種96孔新鮮制備的CEF，培養后選取僅出現單個綠斑的細胞孔中的培養物進行擴繁，此處理對重組病毒的純化也發揮了重要作用。

然而，雖然將mini-F重組HVT病毒從親本病毒中純化出來非常困難，但是在共轉染拯救gC恢復株病毒時，將gC恢復的病毒從mini-F重組病毒中純化則效率很高，僅經過2～3輪的挑斑即獲得了純凈的恢復毒株。這可能是因為HVT在插入外源基因后其細胞結合性增強，還可能是插入外源序列后影響了重組病毒的復制，使得重組毒株在與親本毒株在混合培養過程中處于明顯劣勢，難于將重組毒株分離純化，而gC恢復毒株則具有親本毒株的優勢，易于純化。

截止目前，研究表明所有甲型皰疹病毒的gC都是非必需基因，但對病毒粒子侵入細胞，以及從細胞中釋出都有重要作用，而且gC能激發中和抗體，是皰疹病毒的重要抗原之一，gC基因缺失后對病毒的復制和免疫效力會產生重要影響[31-32]。本研究中gC缺失的HVT重組病毒雖然仍能有效地在細胞與細胞之間傳播，但對病毒侵入細胞的能力損傷嚴重，且導致了病毒的免疫效力大大降低，與其他甲型皰疹病毒gC的功能相似。

4　結　論

作者首次將mini-F序列插入HVT基因組的gC基因等位位點成功構建了HVT全基因組的細菌人工染色體，并證明該細菌人工染色體是一個穩定的感染性克隆，可以用于重組HVT活載體疫苗的研制；HVT的gC基因是一個非必需基因，但對病毒的增殖能力和免疫效力有重要影響。

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(編輯白永平)

Construction and Identification of a Novel Bacterial Artificial Chromosome of Herpesvirus of Turkey

WANG Zhi-sheng1,3，LIU Fang1，2，XU Meng-wei1，2，QIAO Yong-feng1,3，HOU Ji-bo1,3，WANG Ji-chun1,3*

(1.NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicals，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China；3.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

This study was conducted to construct a novel bacterial artificial chromosome (BAC) of herpevirus of turkey (HVT) as a technical platform for generation of recombinant HVT live vectored vaccine.The mini-F sequences were inserted into the genome of HVT in lieu of glycoprotein C (gC) gene through homologous recombination.The mini-F recombinant HVT were selected by GFP and gpt labeling.Then the DNA of mini-F recombinant HVT was transferred intoE.coliDH10B cells to construct the HVT BAC.Following identification of correct construction of HVT whole genome BAC through RFLP method，HVT BAC DNA was transferred intoE.coliGS1783 cells for further study after checking again.Then the HVT BAC was transfected into chicken embryo fibroblasts (CEF) for rescuing of virus.And also thegCrecovered virus was generated by replacement of mini-F sequences withgCgene through homologous recombination again.Finally，the growth characteristics and protective efficacy against Marek’s disease of the gC recovered HVT，mini-F recombinant HVT and the parental virus (HVT FC126) were investigated.Five strains of mini-F recombinant HVT was obtained.One of the five recombinants (HVTmini-F/ΔgC) was selected for isolation of DNA to transfer intoE.coliDH10B cells to construct HVT BAC which was identified successfully through RFLP.Following up，DNA of HVT BAC was transferred intoE.coliGS1783 cells successfully to obtain several positive clones and one of these clones was selected and named BACHVT-G.The recombinant HVT was rescued successfully from BACHVT-G，named HVTBAC-ΔgC.And thegCrecovered virus(HVTBAC-gC-R) was successfully obtained through homologous recombination.The HVTBAC-gC-Rand HVT FC126 showed no significant difference for growth kinetics or immunity.However，the propagation ability of HVTBAC-ΔgCwas significantly decreased compared to HVT and the immunity against MD of HVTBAC-ΔgCwas also decreased.This study successfully constructed a novel HVT bacterial artificial chromosome，which was an infectious clone of the whole genome of HVT.ThegCgene of HVT is a non-essential gene，but plays an important role for propagation of virus.The deletion ofgCgene will reduce the immunity of HVT against Marek’s disease.

herpesvirus of turkey；bacterial artificial chromosome；glycoprotein C；growth kinetics；immune efficiency

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.016

2016-04-11

公益性行業(農業)科研專項(201303046)；江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX(12)3061]；江蘇省自然科學基金項目(BK20131334)

王志勝(1982-)，男，山東濟南人，助理研究員，博士，主要從事畜禽病毒活載體疫苗的研究，E-mail：zhisheng.wang@163.com

王繼春，研究員，E-mail：jcwang@263.net，Tel：025-84392068

S852.659.1

A

0366-6964(2016)10-2071-10