新疆野生一枝蒿粗多糖對(duì)流感疫苗小鼠免疫增強(qiáng)效果的分析

張愛(ài)蓮，王丹陽(yáng)，趙淑述，趙　兵，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

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新疆野生一枝蒿粗多糖對(duì)流感疫苗小鼠免疫增強(qiáng)效果的分析

張愛(ài)蓮*，王丹陽(yáng)，趙淑述，趙兵，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

用新疆野生一枝蒿粗多糖(wildArtemisiarupestrisL.crude polysaccharides，WARCP)通過(guò)肌肉注射免疫小鼠，研究其作為流感病毒疫苗(influenza virus vaccine，IVV)的佐劑效果和節(jié)約流感疫苗抗原用量的作用。WARCP與不同劑量(0.05、0.1、0.5 μg)的IVV配伍，肌肉注射免疫小鼠，觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中抗體IgG及IgG1、IgG2a的水平；MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子CD4+IL-4和CD8+IFN-γ以及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)水平。結(jié)果表明WARCP對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有顯著的影響(P>0.05)；WARCP能夠顯著提高不同劑量IVV特異性IgG及其IgG1、IgG2a的抗體水平(P<0.05)；增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05)；顯著提高IL-4和IFN-γ的分泌水平(P<0.05)；降低Treg細(xì)胞的表達(dá)水平(P<0.05)；尤其可以提高低劑量IVV的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，至少減少抗原用量91%。因此，WARCP作為IVV的佐劑通過(guò)降低Treg細(xì)胞的水平，顯著增強(qiáng)了IVV的免疫效果，尤其是Th1型的免疫反應(yīng)，能夠很好地節(jié)約抗原用量，具有良好的安全性。

流感疫苗；一枝蒿；多糖；節(jié)約抗原；肌肉免疫

流感是一種最常見(jiàn)的危害人類(lèi)健康的傳染病，尤其是在高危人群中，如兒童和老人。研制流感疫苗是針對(duì)預(yù)防流感最有效的一種方法，但是由于流感病毒表面的抗原頻繁突變，在大流感流行的時(shí)候，流感疫苗往往不能夠滿足接種人群的用量。而使用疫苗佐劑可以顯著增強(qiáng)流感疫苗免疫效果，減少流感疫苗的抗原用量，使更多的易感人群接種流感疫苗，達(dá)到迅速應(yīng)對(duì)流感大流行的目的[1]。流感疫苗的佐劑雖然有鋁佐劑和MF59，但是MF59或AS03僅在歐洲流感大流行時(shí)準(zhǔn)予使用[2-3]，目前人們使用的流感疫苗中并不含有佐劑，因此尋找安全有效的佐劑用于流感疫苗，降低抗原的用量，擴(kuò)大流感流行時(shí)接種人群的數(shù)量仍然是流感疫苗研究的重要課題。

傳統(tǒng)的中草藥在人類(lèi)疾病的治療中有悠久的歷史，大量的證據(jù)表明中草藥具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為新型疫苗佐劑的候選資源[4]。多糖是中草藥的主要成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[5-6]。國(guó)內(nèi)外研究者們從多種傳統(tǒng)中草藥中提取多糖成分研究其佐劑效果，如黃芪多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、淫羊藿多糖等發(fā)現(xiàn)其具有很好的佐劑活性，達(dá)到增強(qiáng)免疫功能的作用而成為新型疫苗的候選佐劑[7-11]。

新疆野生一枝蒿(WARCP)主要含有多糖、黃酮等多種化合物[12]，多糖為其主要活性成分之一。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)WARCP與IVV配伍進(jìn)行皮下免疫小鼠后，WARCP具有很好的佐劑效果[13]。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用中IVV多采用肌肉途徑接種，為此本研究將WARCP作為IVV的新型疫苗佐劑，通過(guò)肌肉途徑免疫小鼠，檢測(cè)其免疫增強(qiáng)的效果和節(jié)約抗原用量的作用，評(píng)價(jià)WARCP作為IVV佐劑的可行性，為WARCP作為IVV佐劑的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為后期研制禽流感以及其他病毒疫苗的佐劑奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

新疆野生一枝蒿全草(市售)。季節(jié)性流感病毒裂解疫苗(2014/2015株流感病毒裂解疫苗，主要成分：A/加利福尼亞/7/2009(H1N1) pdm09-衍生株(NYMC X-179A)、A/德克薩斯/50/2012(H3N2)-衍生株(NYMC X-223A)、B/馬薩諸塞/2/2012-衍生株(NYMC BX-51B)(血凝素含量均為30 μg·mL-1)(市售)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG、IgG1、IgG2a購(gòu)自美國(guó)Southbiotech公司。刀豆蛋A(ConA)和脂多糖(LPS)為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品。N-四甲基聯(lián)苯胺( TMB) 購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。流式抗體PE-CD3e、FITC-CD8a、APC-CD4、FITC-CD4、PE-IL-4、PE-IFN-γ、APC-CD25和PE-Foxp3、Fixation/Permeabilization Solution、Perm/Wash buffer、Golgi stop均購(gòu)自美國(guó)BD公司。 Regulatory T Cell Staining Kit購(gòu)自eBioscience公司。RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2新疆野生一枝蒿粗多糖的制備

采用水提醇沉法提取新疆野生一枝蒿粗多糖[14]。用Sevag法對(duì)新疆野生一枝蒿粗多糖除蛋白質(zhì)，得到除蛋白質(zhì)的新疆野生一枝蒿粗多糖粉末[15]。蒽酮-硫酸法[16]測(cè)定新疆野生一枝蒿粗多糖中多糖的含量為30.94%[13]。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與免疫

ICR小鼠，雌性，6～8周齡，18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。40只小鼠隨機(jī)分為8組(表1)。WARCP 300 μg分別與0.05、0.1、0.5 μg IVV配伍后免疫小鼠為試驗(yàn)組，以不同劑量的IVV單獨(dú)免疫組為試驗(yàn)對(duì)照組，生理鹽水免疫組為空白對(duì)照組，IVV與鋁佐劑組為陽(yáng)性對(duì)照組，于0 d和14 d分別進(jìn)行肌肉免疫，體積為100 μL。免疫后不同時(shí)間點(diǎn)稱(chēng)取小鼠體重并觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)。

另取20只小鼠，設(shè)IVV 0.05 μg、IVV 0.05 μg+WARCP 300 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg 4組(n=5)，分別于0 d和14 d進(jìn)行皮下注射免疫，用于分析不同免疫途徑對(duì)抗體滴度的影響。

1.4WARCP免疫后小鼠血清IgG及亞類(lèi)抗體檢測(cè)

初免后7、14、21 d進(jìn)行小鼠眼眶采血，收集上清，用間接ELISA法測(cè)定血清中的抗體水平。簡(jiǎn)述如下：將0.125 μg·mL-1的2014/2015株流感病毒裂解疫苗加入96孔板中，4 ℃過(guò)夜；37 ℃封閉1 h；每孔加入1∶200稀釋后的血清，37 ℃1 h；每孔分別加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃ 1 h；加入TMB底物避光顯色10 min，終止反應(yīng)后OD450/655 nm的條件下測(cè)定吸光度。

表1免疫小鼠分組表

Table 1The group of immunization

分組Groups動(dòng)物Animals數(shù)量Number疫苗(或?qū)φ?Vaccine(orcontrol)1ICR小鼠50.9%NaCl2ICR小鼠5IVV(influenzavirusvaccine)0.05μg3ICR小鼠5IVV0.05μg+WARCP300μg4ICR小鼠5IVV0.1μg5ICR小鼠5IVV0.1μg+WARCP300μg6ICR小鼠5IVV0.5μg7ICR小鼠5IVV0.5μg+WARCP300μg8ICR小鼠5IVV0.1μg+Alum100μg

1.5WARCP免疫后小鼠淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)

小鼠二免后7 d，在無(wú)菌條件下制成脾細(xì)胞懸液，將5×106個(gè)·mL-1脾細(xì)胞懸液加入96孔板，分別加入3.5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的LPS，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL DMSO后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570/630 nm條件下的吸光度，計(jì)算各組刺激指數(shù)(SI)，SI=(各刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)/(未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達(dá)

從小鼠分離得到的脾細(xì)胞，取2×106個(gè)細(xì)胞加入到24孔板里，加入IVV抗原0.6 μg，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。加入Golgi stop過(guò)夜培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，用FITC-CD4進(jìn)行細(xì)胞表面染，室溫避光30 mins。每管加入150 μL Cytofix/Cytoperm(BD)重懸細(xì)胞，4 ℃，30 min；加入1 mL Perm/Wash buffer (BD)，離心，棄上清。加入1 μL 的PE-IL-4和PE-IFN-γ；室溫避光20 min。每個(gè)樣用3 mL 1× Perm/Wash buffer (BD)洗，PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)

制備小鼠二免后7 d的脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將濃度調(diào)整為2×106個(gè)，用eBioscience 的Regulatory T Cell Staining Kit進(jìn)行細(xì)胞染色，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞洗滌后，1 200 r·min-1離心7 min，各加入APC-CD4、FITC-CD25進(jìn)行表面染色，避光室溫 20 min。加固定破膜液120 μL，用1 mL 1× Wash buffer洗一次，各加1 μL PE-Foxp3，室溫孵育20 min。每個(gè)樣加入1 mL wash buffer，離心，棄上清。加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，過(guò)銅網(wǎng)，流式上機(jī)檢測(cè)，用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1WARCP對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響

WARCP與IVV共免疫后，各組小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)表2。表明以WARCP為IVV的佐劑對(duì)小鼠機(jī)體刺激性較小，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響。

2.2WARCP對(duì)IVV誘導(dǎo)小鼠IgG抗體滴度的影響

用間接ELISA法檢測(cè)小鼠初免后不同時(shí)期血清中IgG的抗體滴度，結(jié)果如圖1。隨著免疫后時(shí)間的增加，各組抗體滴度水平也逐漸增加；隨著流感單獨(dú)免疫組IVV劑量的增加，低、中、高劑量組的IgG抗體滴度也逐漸增加；在加入了WARCP300 μg后，流感低劑量、中劑量組的抗體滴度均顯著提高。其中，初免后14 d，低劑量IVV 0.05 μg+WARCP 300 μg與IVV 0.05 μg相比增加了2.5倍，其滴度比高劑量IVV單獨(dú)免疫組還高。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與IVV 0.1 μg相比增加了近1.7倍，其滴度與鋁佐劑組相當(dāng)。但高劑量IVV組加入WARCP300 μg后沒(méi)有顯著提高。

g

各組小鼠免疫后相同時(shí)間的體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

No statistical difference between groups at the same time (P>0.05)

圖1　間接ELISA檢測(cè)初免后不同時(shí)期小鼠血清中IgG的抗體滴度Fig.1　Detection of IgG titer in serum of different times after immunization by indirect ELISA

比較小鼠肌肉免疫和皮下免疫后14 d的血清中IgG的抗體滴度，結(jié)果如圖2，肌肉免疫的IVV單獨(dú)免疫組IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg的抗體滴度均比皮下免疫后的高至少2倍；WARCP300 μg與IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg配伍后，兩種免疫方式各組IgG抗體滴度均比IVV單獨(dú)免疫組有顯著增高，肌肉免疫后的滴度比皮下免疫后的高至少2倍。

2.3WARCP對(duì)IVV誘導(dǎo)小鼠抗體亞類(lèi)的影響

用間接ELISA法檢測(cè)小鼠初免后14 d血清中抗體亞類(lèi)IgG1和IgG2a的水平，結(jié)果如圖3，WARCP 300 μg和低、中劑量IVV0.05 μg、IVV0.1 μg配伍后的血清IgG1和IgG2a抗體水平均顯著高于低、中劑量的IVV單獨(dú)免疫組(P<0.05)，其中，中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對(duì)照組IVV 0.1 μg+Alum相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；各

圖2　間接ELISA檢測(cè)不同免疫途徑初免后14 d小鼠血清中IgG的抗體滴度Fig.2　Detection of IgG titer in serum of 14 d after immunization from different immune pathway by indirect ELISA

免疫組IgG1的抗體水平均高于IgG2a的抗體水平。但高劑量IVV組加入WARCP300 μg后的血清IgG1和IgG2a抗體水平均沒(méi)有顯著提高。

2.4WARCP對(duì)IVV誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)初免后21 d各組小鼠淋巴細(xì)胞的增殖情況，加入濃度為3.5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的LPS刺激物后各組的刺激指數(shù)如圖4：隨著IVV 0.05 μg、IVV 0.1 μg、 IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，其刺激指數(shù)也不斷升高。ConA和LPS誘導(dǎo)WARCP 300 μg配伍的IVV 低劑量、中劑量組淋巴細(xì)胞的增殖活性顯著升高 (P<0.05)，高劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外，中劑量IVV 0.1 μg + WARCP 300 μg與鋁佐劑組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨(dú)免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01 Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01 圖3　間接ELISA檢測(cè)初免后14 d小鼠血清中抗體分型的水平Fig.3　Detection of antibody subclasses in serum by indirect ELISA in 14 d after first immunization

與IVV單獨(dú)免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖4　MTT法檢測(cè)初免后21 d小鼠脾中淋巴細(xì)胞的增殖Fig.4　Detection of splenocyte proliferation by MTT in 21 d after first immunization

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的水平

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初免后21 d各組小鼠的CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5：隨著單獨(dú)免疫IVV 0.05 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，CD4+IL-4、CD8+IFN-γ分泌水平也不斷升高。WARCP 300 μg配伍的低劑量、中劑量組的CD4+IL-4、CD8+IFN-γ分泌水平顯著高于低劑量、中劑量IVV單獨(dú)免疫組(P<0.05)，WARCP 300 μg配伍高劑量IVV組無(wú)顯著差異(P>0.05)。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對(duì)照組IVV 0.1 μg+Alum相比CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的分泌水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨(dú)免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖5　WARCP對(duì)流感疫苗免疫后小鼠脾分泌CD4+IL-4、CD8+IFN-γ水平的影響Fig.5　The secretion level of CD4+IL-4，CD8+IFN-γ in the spleen of mice immunized with IVV mixed WARCP

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)

為了檢測(cè)免疫后各組小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果如圖6：隨著單獨(dú)免疫組IVV0.05 μg、IVV 0.1 μg、IVV 0.5 μg劑量的不斷增加，CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)水平也不斷降低。WARCP 300 μg配伍IVV低劑量、中劑量組的CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)水平顯著低于IVV低劑量、中劑量單獨(dú)免疫組(P<0.05)，WARCP 300 μg配伍IVV高劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)。中劑量IVV 0.1 μg+WARCP 300 μg與對(duì)照組Alum相比CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

與IVV單獨(dú)免疫組相比較，*.P<0.05，**.P<0.01Compared with IVV immunization group，*.P<0.05；**.P<0.01圖6　WARCP對(duì)流感疫苗免疫后小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比的影響Fig.6　The percentage of CD4+CD25+Foxp3+Treg cell in the spleen of mice immunized with IVV mixed WARCP

3　討　論

隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的中草藥組分被鑒定和分離出來(lái)，其中包括多糖、皂素、酚類(lèi)化合物及類(lèi)黃酮等，這些組分作為佐劑能促進(jìn)激活抗原遞呈細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成，增強(qiáng)抗腫瘤和抗感染的免疫反應(yīng)[17]。尤其是補(bǔ)益類(lèi)中藥的有效成分，能影響機(jī)體的免疫功能，很有希望開(kāi)發(fā)成為新型疫苗佐劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多糖類(lèi)作為佐劑不僅可以通過(guò)激活T、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可以通過(guò)激活補(bǔ)體，促進(jìn)干擾素生成，誘生細(xì)胞因子等方式得以實(shí)現(xiàn)[18]。本研究旨在探討WARCP作為IVV的佐劑，加強(qiáng)IVV的免疫效果和節(jié)約IVV抗原用量的作用。將一定劑量的WARCP與不同劑量的IVV配伍后免疫小鼠作為試驗(yàn)組，以不同劑量IVV單獨(dú)免疫小鼠為無(wú)佐劑對(duì)照組，鋁佐劑組作為陽(yáng)性對(duì)照組，肌肉途徑進(jìn)行免疫，檢測(cè)WARCP與IVV配伍后對(duì)小鼠免疫應(yīng)答的增強(qiáng)效果。

研究發(fā)現(xiàn)，WARCP配伍IVV肌肉途徑免疫小鼠后，各組小鼠體重均沒(méi)有顯著差異，也沒(méi)有明顯的過(guò)敏反應(yīng)，表明WARCP并未對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生影響，WARCP具有一定的安全性。合適的抗原劑量與合適多糖劑量配伍才會(huì)起到理想的免疫效果。IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，其含量高低可以反映機(jī)體的防御能力[19]。抗體IgG滴度結(jié)果表明，WARCP可以顯著提高IVV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體滴度，IVV低劑量組加入WARCP后與IVV高劑量單獨(dú)組相比可減少抗原用量91%，WARCP顯著增強(qiáng)了IVV激起的體液免疫應(yīng)答水平，并節(jié)約抗原的用量，這表明通過(guò)本試驗(yàn)確定了合適的抗原劑量與多糖的劑量配伍，因此起到了很好的免疫增強(qiáng)效果[20-21]。為了比較不同的免疫途徑對(duì)小鼠抗體水平的影響，對(duì)初免后14 d的IgG滴度進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉途徑免疫后各組的抗體滴度水平均比皮下免疫高至少2倍，說(shuō)明肌肉免疫途徑效果優(yōu)于皮下免疫。

在小鼠體內(nèi)，IgG1是依賴(lài)Th2途徑免疫應(yīng)答的特征性標(biāo)志，而IgG2a是依賴(lài)Th1途徑免疫應(yīng)答的特征性標(biāo)志[22]。初免后14 d小鼠血清抗體亞類(lèi)IgG1和IgG2a的結(jié)果表明：WARCP配伍低、中、高劑量的IVV后均能同時(shí)提高流感低、中劑量IVV的IgG1和IgG2a的水平，說(shuō)明WARCP作為IVV的佐劑能夠同時(shí)促進(jìn)Th1和Th2免疫反應(yīng)，尤其可以提高Th1型的免疫反應(yīng)。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的高低可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，常用淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫能力[19]。本研究結(jié)果表明WARCP能顯著性地提高ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖，WARCP與低劑量IVV配伍組的刺激指數(shù)和高劑量IVV單獨(dú)免疫組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明WARCP能夠顯著提高流感疫苗的細(xì)胞免疫水平。

在免疫應(yīng)答識(shí)別和激活階段，有多種細(xì)胞因子可刺激免疫活性細(xì)胞的增殖，IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，還可以激活CTL[18]。IL-4主要產(chǎn)生于活化T細(xì)胞和肥大細(xì)胞中，它可以刺激B淋巴細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-4、CD8+IFN-γ的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WARCP均能顯著提高低、中劑量IVV的IL-4和IFN-γ表達(dá)水平，表明WARCP與IVV配伍后可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

Foxp3對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)展和功能是至關(guān)重要的，起到免疫抑制的調(diào)節(jié)作用[23]。有研究發(fā)現(xiàn)川牛膝多糖作為佐劑通過(guò)抑制CD4+CD25+Foxp3+的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)WARCP作為低、中劑量IVV的佐劑能顯著降低CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)。這些結(jié)果表明，WARCP能夠通過(guò)抑制Treg細(xì)胞的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

綜上所述，新疆野生一枝蒿粗多糖通過(guò)肌肉途徑免疫后可以增強(qiáng)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，效果優(yōu)于皮下免疫途徑，尤其是激發(fā)了Th1型免疫反應(yīng)并抑制了Treg細(xì)胞的表達(dá)，可以節(jié)約抗原用量91%。因此，新疆野生一枝蒿粗多糖可以為流感病毒疫苗新型免疫佐劑的研制及用于解決流感大暴發(fā)時(shí)流感疫苗供應(yīng)短缺問(wèn)題提供重要的研究參考。

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(編輯白永平)

The Analysis of Immune Enhancement Effect of Xinjiang WildArtemisiarupestrisL.Crude Polysaccharides on Influenza Viruses Vaccines in Mice

ZHANG Ai-lian*，WANG Dan-yang，ZHAO Shu-shu，ZHAO Bing，ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering，CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China)

The immune effects of Xinjiang WildArtemisiarupestrisL.crude polysaccharides (WARCP) as an adjuvant and sparing antigen on different doses of influenza virus vaccine (IVV) were explored.ICR mice were intramuscularly immunized respectively with different doses (0.05，0.1，0.5 μg) of the IVV alone or co-administered with 300 μg WARCP at 0 d and 14 d.The growth state of mice were observed，antibody level of IgG and IgG1，IgG2ain serum were tested by ELISA；splenocyte proliferations were tested by MTT；The expression levels of CD4+IL-4，CD8+IFN-γ and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells were tested by flow cytometry.The results showed that no significant differences in the body weight were observed between mice from different groups (P>0.05)；WARCP can significantly improve the antibody level of influenza-specific IgG and IgG1，IgG2a(P<0.05)；WARCP can significantly promote lymphocyte proliferation，the secretion level of IL-4 and IFN-γ (P<0.05),and significantly reduce the level of expression of Treg cells (P<0.05)；In particularly，it can enhance the humoral and cellular immunity responses of low-dose IVV,indicating an at least 91% reduction in vaccine dosage by adding WARCP as adjuvant.These results indicated that adding WARCP to IVV enhanced the immune efficacy of IVV by reducing the level of Treg cells，significantly promote Th1-type immune response particularly，it can be an adjuvant with the advantages of high safety and dose-sparing.

influenza virus vaccine；ArtemisiarupestrisL.；polysaccharides；antigen sparing；intramuscle immunity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.018

2016-05-16

自治區(qū)自然科學(xué)基金(201404061219)

張愛(ài)蓮(1968-)，女，山東東明人，副教授，博士，主要從事疫苗佐劑方面的研究，Tel：0991-5523400

張愛(ài)蓮，副教授，E-mail：xjzal@163.com

S852.52

A

0366-6964(2016)10-2089-09