轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的變化*

賀可貴，閔祥棟，王云，韓紀舉，辛曉明，趙曉民

（1.泰山醫學院藥理學教研室，山東 泰安 271016；2.泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000）

轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附聚集功能的變化*

賀可貴1，閔祥棟1，王云2，韓紀舉2，辛曉明1，趙曉民1

（1.泰山醫學院藥理學教研室，山東 泰安 271016；2.泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000）

目的探討轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠血小板黏附和聚集功能的變化。方法選用12～14周齡轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠和C57BL/6J小鼠，戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，肝素抗凝，全自動血細胞分析儀測定血小板參數，灌流小室法測定血小板在膠原面的黏附變化，比濁法測定不同濃度二磷酸腺苷誘導下的血小板最大聚集率。結果與轉基因增強綠色熒光蛋白雄性小鼠比較，雌性小鼠的血小板數、血小板平均體積、血小板壓積、黏附率和最大聚集率（二磷酸腺苷3、10和30μmol）下降（P<0.05）；與C57BL/6J雌性小鼠比較，轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠血小板數降低（P<0.05）。結論轉基因增強綠色熒光蛋白雌雄小鼠之間血小板數、血小板平均體積、血小板壓積和黏附聚集功能有差異，轉基因增強綠色熒光蛋白小鼠與C57BL/6J雌性小鼠之間血小板數也有差異。

血小板；轉基因；增強綠色熒光蛋白；黏附；聚集

轉基因增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）小鼠是在C57BL/6J小鼠的基因組中導入ACTB-EGFP基因，在小鼠體內表達產生熒光蛋白。在紫色光照射下，該蛋白產生綠色熒光，也使得小鼠整個身體呈現綠色熒光。除毛發和紅細胞外，ACTB-EGFP基因在其他細胞中均能表達,因此，在熒光顯微鏡下其他組織均可產生熒光[1-2]。目前,綠色熒光蛋白轉基因小鼠是一種重要的工具小鼠，現已在發育、免疫、細胞生物學等研究中不可或缺[3]，為胚胎干細胞、人類基因功能、人體組織工程和克隆器官等提供基礎研究。

血小板黏附聚集功能在出血和缺血性疾病中起重要作用，利用轉基因EGFP小鼠進行黏附功能的測定及熒光成像具有操作簡單、所得結果直觀、靈敏度高等特點，可廣泛應用于活體動物體內成像[4-6]。由于血小板在熒光顯微鏡下顯示熒光，因此不需染色，黏附實驗圖像采集可直接在熒光顯微鏡下進行，計算黏附面積或者熒光強度即可，簡單方便。關于轉基因EGFP小鼠黏附聚集功能的研究較少，目前YANG等人[7]將EGFP作為Gz敲除的報告基因，觀察血小板Gz對聚集的影響。付斌等人[8]對血小板特異性整合蛋白儀αⅡbβ3有所研究。本實驗對轉基因EGFP小鼠血小板黏附聚集功能進行測定，并與C57BL/6J小鼠進行比較，為該小鼠血小板方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物

選用12～14周齡轉基因EGFP小鼠和C57BL/ 6J小鼠各15只，體重20～25g。轉基因C57BL/16-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠由復旦大學實驗動物中心惠贈，C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）20120001]，飼料由北京科奧協力飼料有限公司提供，飼養環境溫度18～26℃，相對濕度50%～70%，光照明暗交替12 h/d，動物自由進食飲水。

1.2儀器

CHRONO-LOG血小板聚集分析儀（美國Chrono-Log公司，MODEL 700型），臺式離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司，TG16-WS型），全自動血細胞分析儀（深圳市康普電子有限公司，PE-6800VET型），灌流小室由荷蘭烏特勒茲大學血栓與止血實驗室提供，循環水式多用真空泵（鄭州城科工貿有限公司，SHB-Ⅲ型），數顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠，BT-100B型），顯微鏡（日本Olympus公司，BX51型），Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM圖像采集分析處理系統，電子天平（上海精密科學儀器有限公司，JA31001型）。

1.3藥物與試劑

戊巴比妥鈉（Merck，北京金鑫天佑分裝），0.9%生理鹽水（山東魯抗辰欣藥業有限公司），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（美國Sigma公司），牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（美國Sigma公司），肝素鈉注射液（上海第一生化藥業有限公司）。膠原的制備：斷頭處死老年大鼠（>50周齡），取鼠尾洗凈后置于75%酒精中浸泡5min，取出尾腱后在生理鹽水中浸泡1h，吸干水分稱重、剪碎，放入0.1 mol醋酸溶液中（4%）攪拌溶解。4℃放置24 h后4 000 r/min離心15min取上清即成。

1.4血小板參數測定

動物以戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，心臟取血肝素抗凝[9]，全自動血細胞分析儀檢測血小板數、血小板平均體積、血小板壓積和血小板平均寬度。再將血液分成兩部分，分別檢測血小板黏附率和聚集率。

1.5血小板黏附率測定

用氮氣噴槍將0.1 mol醋酸溶解的膠原蛋白均勻噴到蓋玻片（1.2 mm×1.2 mm）上，每片膠原蛋白含量20μg。在1%BSA中封閉15min后，包被膠原蛋白的蓋玻片放置在灌流小室上，調整血液流速，流經灌流小室產生300/s切變率，每只動物的肝素抗凝血灌流時間分別為4和5min，重復3次。血液灌流結束，HEPES溶液沖洗蓋玻片，分別經戊二醛、甲醇固定，May-Grünwald-Giemsa液染色，在400倍鏡下每片隨機選取10個視野，Image-Pro Plus-Version 4.0 for WindowsTM圖像采集分析處理系統計算各視野血小板黏附率（血小板面積/整個視野面積），10個視野血小板黏附率的均值為單次血小板黏附率，3次血小板黏附率的均值為一只動物的血小板黏附率[10]。

1.6血小板聚集率檢測

將肝素抗凝血離心（1 100 r/min）10 min，吸出上層富血小板血漿后，再以3 800 r/min離心10 min制備貧血小板血漿。先用貧血小板血漿調整富血小板血漿血小板數為300×109/L，再用生理鹽水將血小板數調整至200×109/L，貧血小板血漿按照同比例加生理鹽水稀釋作為聚集參照，應用CHRONO-LOG血小板聚集分析儀，分別加入終濃度為3、10和30μmol ADP，測定血小板最大聚集率來反映血小板聚集率的變化。

1.7統計學方法

采用Graphpad Instat V3.0統計軟件進行數據處理，計量數據用均數±標準差（x±s）表示，用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板參數變化

轉基因EGFP雄性小鼠與轉基因EGFP雌性小鼠血小板數、血小板平均體積、血小板壓積比較，經t檢驗，差異有統計學意義，轉基因EGFP雄性小鼠血小板數、血小板平均體積、血小板壓積高于轉基因EGFP雌性小鼠；轉基因EGFP雌性小鼠與C57BL/6J雌性小鼠血小板數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.517，P=0.002），轉基因EGFP雌性小鼠血小板數低于C57BL/6J雌性小鼠；但轉基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間上述血小板參數差異無統計學意義。見表1。

表1　轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板參數比較（±s）

表1　轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板參數比較（±s）

注：1）與轉基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05；2）與C57BL/6J雌性小鼠比較，P<0.05

組別血小板數（×109/L）血小板壓積/%轉基因EGFP小鼠雄性659.3±47.31）9.7±0.41）8.3±0.20.60±0.01）雌性503.1±34.52）8.2±0.98.1±0.50.45±0.1 t值5.9663.4060.8303.355 P值0.0000.0090.4300.010 C57BL/6J小鼠雄性628.9±66.89.9±1.08.5±0.60.6±0.1雌性588.7±24.68.9±0.48.3±0.30.5±0.1 t值1.2622.0760.6671.581 P值0.2420.0720.5240.153血小板平均體積/fl血小板分布寬度/%

2.2轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板黏附率

表2　轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比較（%±s）

表2　轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠血小板黏附率比較（%±s）

注：?與轉基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05

血小板黏附率灌流4min灌流5min轉基因EGFP小鼠雄性52.4±7.8?56.5±8.9雌性42.9±4.451.9±7.2 t值2.3720.899 P值0.0450.355 C57BL/6J小鼠雄性48.4±7.257.0±5.1雌性44.0±4.756.6±4.8 t值1.1440.128 P值0.2860.902組別

轉基因EGFP雄性小鼠與轉基因EGFP雌性小鼠血小板黏附率比較，經t檢驗，灌流時間為4 min時差異有統計學意義，轉基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于轉基因EGFP雌性小鼠；但轉基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間血小板黏附率差異無統計學意義。見表2。

2.3轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率

轉基因EGFP雄性小鼠與轉基因EGFP雌性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率比較，經t檢驗，差異有統計學意義，轉基因EGFP雄性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率高于轉基因EGFP雌性小鼠；C57BL/6J雄性小鼠與C57BL/6J雌性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率比較，經t檢驗，差異有統計學意義，C57BL/6J雄性小鼠不同ADP濃度下的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之間不同ADP濃度下的血小板最大聚集率差異無統計學意義。見表3。

表3　轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比較（%±s）

表3　轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板最大聚集率比較（%±s）

注：1）與轉基因EGFP雌性小鼠比較，P<0.05；2）與C57BL/6J雌性小鼠比較，P<0.05

組別血小板最大聚集率ADP 3μmolADP 10μmolADP 30μmol轉基因EGFP小鼠雄性53.9±4.11）62.3±1.21）69.3±8.11）雌性33.0±1.455.0±1.756.0±1.7 t值10.7877.8443.593 P值0.0000.0000.007 C57BL/6J雄性49.8±7.52）66±3.72）69.8±5.72）雌性34.8±1.753.5±0.660.2±3.9 t值4.3617.4573.108 P值0.0000.0000.015

3 討論

血小板活化在出血、止血和血栓形成過程中非常重要，與多種疾病有關，如動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、腦血管疾病等，也是炎癥易化及進展的關鍵環節之一。血小板活化重要的表現為黏附和聚集功能的增強[11]。了解實驗動物血小板的活化有助于利用該種動物開展相關疾病的研究[12]。

研究血小板參數是評價血小板功能的基本指標。轉基因EGFP雄性小鼠血小板數、血小板平均體積、血小板壓積高于轉基因EGFP雌性小鼠，提示轉基因EGFP雌雄小鼠之間血小板功能可能有差別，這種差異也存在于C57BL/6J雌雄小鼠之間。另外,. 6J雌性小鼠。

為進一步明確轉基因EGFP小鼠血小板功能，筆者觀察了血小板黏附、聚集變化。與上述血小板參數變化相似，灌流時間為4 min時轉基因EGFP雄性小鼠血小板黏附率高于轉基因EGFP雌性小鼠，進一步證明轉基因EGFP小鼠血小板功能的性別差異。但轉基因EGFP和C57BL/6J雄性小鼠之間和C57BL/6J雄性小鼠與雌性小鼠之間血小板黏附率差異無統計學意義。不同ADP濃度下，轉基因EGFP雄性小鼠的血小板最大聚集率高于轉基因EGFP雌性小鼠；同樣，不同ADP濃度下，C57BL/6J雄性小鼠的血小板最大聚集率高于C57BL/6J雌性小鼠；但不同ADP濃度下，轉基因EGFP小鼠和C57BL/6J小鼠之間的血小板最大聚集率差異無統計學意義。

EGFP被廣泛用于報告基因來檢測目標基因在特定組織和器官的表達。迄今為止，體外研究發現EGFP對細胞基本無毒害，大部分在體研究結果與體外研究結果一致。SHEEN等[13]證實，在玉米轉基因植株中，即使EGFP在細胞中有很高的表達量，對細胞也不會產生明顯毒害。根據本實驗數據可知，轉基因EGFP雌雄小鼠之間血小板功能有差異，但除了轉基因EGFP雌性小鼠血小板數低于C57BL/6J雌性小鼠外，轉基因EGFP小鼠血小板和C57BL/6J小鼠血小板之間是無差異，提示轉EGFP基因可能會對小鼠血小板有影響，但仍需進一步確定。

轉基因EGFP小鼠是在C57BL/6J小鼠的基礎上構建成功，但在血小板參數等指標上確實存在差異，這與田小蕓等[1]所得出的結論一致。病理檢測發現轉基因EGFP小鼠部分胸腺發育缺陷，推測綠色熒光蛋白可能影響動物的發育[14]，提示這也可能是EGFP基因影響雌性小鼠血小板功能的原因。

每個品種品系的動物都有其自身的生物學特征，這也是區別其他動物的基礎[2]，由于性別不同某些生理特性有所不同[1]。本實驗所測血小板參數指標中，雄性小鼠的血小板數、血小板平均體積、血小板壓積高于雌性小鼠；血小板功能指標中，雄性小鼠的血小板黏附面積和最大聚集率均高于雌性小鼠，雖然雌雄之間有差異，但在正常波動范圍內[15-19]。

本實驗通過對轉基因EGFP小鼠與C57BL/6J小鼠血小板參數、黏附和聚集功能變化的測定，觀察兩種小鼠及其性別之間的差異，為轉基因C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10 sb/J小鼠資料庫的建立提供參考。但轉基因EGFP雌性小鼠血小板功能改變的內在機制還需進一步研究。

[1]田小蕓,惲時鋒,胡玉紅,等.轉基因EGFP小鼠血液生理生化指標的測定[J].實驗動物科學,2008,25(5):56-58.

[2]田小蕓,惲時鋒,胡玉紅,等.轉基因EGFP小鼠的主要臟器重量及臟器系數[J].中國比較醫學雜志,2008,18(1):32-33.

[3]周揚,張滕,潘慶杰.外源基因Egfp在轉基因小鼠中的遺傳和表達穩定性研究[J].青島農業大學學報（自然科學版）,2013,30(3): 157-161.

[4]張余琴,林曉琳,賈俊雙,等.紅色熒光蛋白和熒光素酶雙報告基因轉基因小鼠的建立[J].中國癌癥雜志,2012,22(5):321-328.

[5]沈艷華,王麒龍,代興亮,等.同源導入近交系綠色熒光裸小鼠Foxn1~(nu).B6-CAG-EGFP/SU的建立[J].中國比較醫學雜志,2015, 1:55-58.

[6]賀曉玉,何君,徐艷峰,等.綠色熒光蛋白轉基因小鼠生理生化常數的研究及應用[D].北京:北京協和醫學院（中國醫學科學院）,2011.

[7]YANG J,WU J,KOWALSKA M A,et al.Loss of signaling through the G protein,Gz,results in abnormal platelet activation and altered responses to psychoactivedrugs[J].Proc Natl Acad Sci USA.2000,97(18):9984-9989.

[8]付斌,傅敢,陳方平,等.綠色熒光蛋白（GFP）融合于人整合蛋白α_(Ⅱb)C端不影響α_(Ⅱb)β_3復合物在CHO細胞正常表達[J].中國實驗血液學雜志,2005,13(2):182-187.

[9]常歡,王云,韓紀舉,等.一種小鼠心臟取血的改良方法[J].泰山醫學院學報,2014(35):411-412.

[10]王云,韓繼舉,趙曉民,等.蒺藜總黃酮對大鼠血小板黏附和聚集功能的影響[J].中國醫院藥學雜志,2011,31(20):1714-1716.

[11]季明德.血小板活化的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(2): 218-220.

[12]謝曉民,陳晶.血小板活化與相關疾病的研究進展[J].河北醫藥, 2012,34(3):437-439.

[13]CHONGMEI D,PETER B,KATE V,et al.Oligonucleotide-directedgene repair in wheat using a transient plasmid gene repair assaysystem[J].Plant Cell Reports,2006,25(5):457-465.

[14]賀曉玉,何君,徐艷峰,等.綠色熒光蛋白轉基因小鼠的生理生化常數及應用[J].中國實驗動物學報,2011,19(2):145-149.

[15]YANG M,REYNOSO J,JIANG P,et al.Transgenic nude mouse with ubiquitous green fluorsent protein expression as a host for human tumors[J].Cancer Res,2004,64:8651-8656.

[16]DICKSON R M,CUBITT A B,TSIEN R Y,et al.On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein[J].Nature,2013,388(6640):355-358.

[17]HAN X,WANG L,LI W,et al.Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus plantarum in the gastrointestinal tract of goats[J].Braz J Microbiol,2015,46(3):849-854.

[18]SANGMI C,THERESE A,KAI-C S,et al.Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines[J].Stem Cell,2002,20:139-1451

[19]CABANTOUS S,TERWILLIGER T C,WALDO G S.Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein[J].Nature Biotechnology,2005,23(1): 102-107.

（申海菊編輯）

Changes of platelet adhesion and aggregation function in transgenic EGFP mice*

Ke-gui He1，Xiang-dong Min1，Yun Wang2，Ji-ju Han2，Xiao-ming Xin1，Xiao-min Zhao1
（1.School of Pharmacology Sciences，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271016，China；2.Institute of Atherosclerosis，Taishan Medical University，Taian，Shandong 271000，China）

Objective To measure the changes of platelets adhesion and aggregation function in transgenic enhanced green fluorescent protein（EGFP）mice.Methods Transgenic EGFP and C57BL/6J mice（12-16 weeks，both male and female）were used for the present study.The mice were anesthetized with Pentobarbital sodium and blood was taken from the heart anticoagulated with Heparin.Platelet parameters were measured using an automated blood cell analyzer.Platelet adhesion on collagen surface was evaluated using a welldefined perfusion chamber.The maximum aggregation rate of platelets induced by ADP was determined by turbidimetry.Results In transgenic EGFP mice，platelet count，mean platelet volume（MPV），plateletcrit（PCT），adhesion rate and the maximum aggregation rate（ADP final concentration was 3 μmol，10 μmol and 30 μmol respectively）of the female mice were decreased compared with those of the male ones（P＜0.05）.In the female mice，platelet count of the transgenic EGFP mice were decreased compared with that of the C57BL/6J mice（P＜0.05）.Conclusions There are differences in platelet count，MPV，PCT，adhesion rate and the maximum aggregation rate between male and female transgenic EGFP mice.There is also difference in platelet countbetween female transgenic EGFP mice and C57BL/6J mice.

platelet；transgene；enhanced green fluorescent protein；adhesion；aggregation

R 331.143

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.002

1005-8982（2016）19-0006-05

2016-03-23

國家自然科學基金（No：81173061）；泰山地產中藥研發協同創新中心基金，山東省自然科學基金（No：ZR2014HQ007），泰安市科技發展計劃項目（No：201440774-25）

賀可貴，現在寧陽縣人民醫院臨床藥學部。E-mail：hekegui0724@yeah.net

趙曉民，E-mail：zhaoxiaominty@163.com