低密度脂蛋白受體基因rs688位點多態性與缺血性腦血管病的相關性研究*

李娜，鄭偉，胡曉芳

（1.錦州醫科大學研究生院，遼寧 錦州 121001；2.沈陽軍區總醫院檢驗科，遼寧 沈陽 110016）

低密度脂蛋白受體基因rs688位點多態性與缺血性腦血管病的相關性研究*

李娜1，鄭偉2，胡曉芳2

（1.錦州醫科大學研究生院，遼寧 錦州 121001；2.沈陽軍區總醫院檢驗科，遼寧 沈陽 110016）

目的探討低密度脂蛋白受體（LDLR）rs688基因多態性與缺血性腦血管病(ICVD)發生的相關性。方法分別檢測264例ICVD患者及180例對照組LDLR的rs688基因多態性、血清LDL、總膽固醇（TC）和Toll樣受體2（TLR 2）水平。結果LDLRrs688基因型分布和T等位基因頻率，差異有統計學意義（P<0.05）。TT型和總膽固醇型血清LDL、TC水平高于CC基因型，差異有統計學意義（P<0.05），但TT型和總膽固醇型比較，差異無統計學意義（P>0.05）。ICVD組患者的血清LDL、TC、TLR 2水平高于對照組，差異有統計學意義（P< 0.01）。相關分析結果顯示，ICVD組患者血清TLR 2與血清LDL水平呈正相關（r=0.801，P<0.05）。結論高濃度LDL、總膽固醇血癥是導致ICVD發生的獨立危險因素。而LDLRrs688的T等位基因是ICVD發病的易感基因，該基因突變可能通過上調血清LDL、TC、TLR 2水平進而介導ICVD的發生。TLR 2與血清LDL之間存在的正反饋調節機制的過度活化，可能是介導ICVD發生的重要因素。

缺血性腦血管?。坏兔芏戎鞍资荏w；基因多態性

急性腦血管病是神經系統常見病，多發病，病情危急，易復發，其高致殘率、高死亡率成為影響中老年人生命質量最嚴重的疾病之一[1-4]。其中，缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）占腦血管病的80%[5]。因此，更深入闡明ICVD的發病機制是目前亟待解決的重點課題。

有研究顯示，血脂代謝異常是導致ICVD發生的主要致病因子[6]，而低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）作為介導血脂代謝的關鍵效應分子[7]，其基因多態性是否通過影響血脂代謝水平，進而參與ICVD的發生，目前尚未充分闡明。本研究聚焦于ICVD患者LDLRrs688基因多態性的變化特點，比較不同基因型患者低密度脂蛋白（low-densitylipoprotein，LDL）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和Toll樣受體2（Toll like receptor-2，TLR2）水平的差異，旨在探討ICVD發生的相關性及其可能機制，進而為ICVD的診斷提供有益的新的線索。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月-2013年12月沈陽軍區總醫院神經內科住院的ICVD患者264例為ICVD組。其中，男性122例，女性142例；平均（61.22±11.14）歲。入組標準：首次發病，未進行降脂、抗凝治療?；颊呔酗B腦CT和/或MRI影像證據，診斷符合1995年全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準[3]。排除有肝腎疾病、糖尿病、惡性腫瘤、甲狀腺功能異常、妊娠、服用抗驚厥藥物者。無酗酒史，未服用免疫抑制劑、多種維生素及葉酸。對照組為本院同期無腦血管疾病的漢族健康體檢者180例。其中，男性90例，女性90例；平均（60.85±10.33）歲。兩組在年齡、性別方面差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（美國ABI公司），紫外分光光度計（日本島津公司），電泳槽及電泳儀（美國EC公司），凝膠成像系統（日本Kodak公司），日立008全自動生化分析儀（日本日立公司）。全血DNA提取試劑盒、PCR反應試劑、DNA Marker、Loading buffer均為寶生物工程大連有限公司產品，瓊脂糖（美國Promega公司），溴化乙錠（美國Amresco公司），LDL、TC、TLR2檢測試劑盒（購自武漢優爾生化學生物工程有限公司）。

1.2.2標本采集與指標檢測ICVD組（于確診入院的第1天清晨）及對照組在空腹狀態下采集前臂無抗凝靜脈血和乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血各3ml。無抗凝靜脈血1 h內離心（3 000 r/min，10 min）分離血清后，置于-70℃冰箱冷凍保存待測。乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血置于-70℃冰箱冷凍保存，待提取DNA。全自動生化分析儀檢測血清LDL、TC濃度，酶聯免疫吸附法測定血清中TLR2含量，所有操作嚴格按說明書進行。

1.2.3全血基因組DNA提取全血DNA提取試劑盒提取人全血DNA，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。測定各樣品OD260和OD280吸光度值，根據OD260/OD280值分析DNA樣品的純度。

1.2.4PCR引物設計與合成PCR引物序列參考文獻[1]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（PAGE級純化，純度≥99%）。PCR產物片段長度為200bp。正向引物：5'-CGCCTCTACTGGGTTGAC T-3'，反向引物：5'-CATCTTGGCTTGAGTGATCT-3'。1.2.5實時PCR擴增LDLRrs688基因片段使用PCR反應試劑（Prime STAR HS DNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg+），反應體系為：DNA模板5μl，Primer1、Primer 2各2μl（濃度為20μmol），Prime STAR HS DNA聚合酶0.5μl，5×buffer 10μl，dNTP 4μl加滅菌蒸餾水28.5μl，使最終總體系為50μl。

1.2.6PCR循環程序設置使用ABI-7500 PCR儀，98℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢查后，于4℃保存擴增產物，送至上海生工生物工程技術服務有限公司完成基因測序，得出基因型。根據測序結果分為TT、TC和CC 3組。

1.2.7PCR產物檢測取5μl PCR產物，制備3%的瓊脂糖凝膠電泳（40ml Tris硼酸，1.2g瓊脂糖，內含0.5μg/ml溴化乙錠），倒入模具中待其自然凝固后，在電泳槽中倒入0.5×Tris硼酸電泳緩沖液。將PCR產物與Loading buffer混勻后上樣，同時一側加樣孔加入2000bp DNA Marker作為對照。

1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，基因型采用頻率計數法，用Hardy-Weinberg平衡定律計算等位基因頻率。組間基因型及等位基因頻率比較用χ2檢驗。組間比較用t檢驗、方差分析。相關性分析用Spearman相關檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組的血脂水平比較

ICVD組血清LDL（3.6±1.3）mmol/L、TC（5.6± 1.6）mmol/L，均高于對照組，差異有統計學意義。見表1。

表1　兩組血脂水平比較（mmol/L±s）

表1　兩組血脂水平比較（mmol/L±s）

注：?與對照組比較，P<0.05

組別LDLTC ICVD組（n=264）3.6±1.3?5.6±1.6?對照組（n=180）2.4±0.84.6±1.0 t值4.843.37 P值0.0000.001

2.2LDLR rs688多態性結果

PCR產物電泳結果顯示，目的基因產物的片段長度為200 bp（見圖1）。對PCR產物進行基因測序，分別得到LDLRrs688基因的TT型、TC型和CC型（見圖1中2～4箭頭所指位點位置）。

圖1　PCR產物電泳圖

2.3兩組的LDLR rs688基因型分布比較

ICVD組和對照組的LDLRrs688基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，各等位基因均達到遺傳平衡，具有群體代表性。ICVD組與對照組間LDLRrs688的3種基因型（TT、TC、CC）頻率分別為3.8%、24.2%、72.0%，2.2%、8.9%、88.9%，兩組基因型分布差異有統計學意義。ICVD組T等位基因頻率為15.9%，高于對照組6.7%。各組基因型分布及等位基因頻率結果見表2。

表2　兩組LDLRrs688基因型及等位基因分布比較

2.4LDLRrs688基因多態性與血清LDL、TC、TLR2水平的關系

ICVD組3種基因型血清LDL、TC水平均高于對照組（FLDL=14.12，FTC=6.74，P=0.001）。ICVD組及對照組TT型和TC型LDL水平分別高于CC基因型（F=3.11，P=0.034），但TT型和TC型血清LDL水平比較差異無統計學意義（F=2.13，P=0.065），ICVD組及對照組的3種基因型TC水平與LDL水平一致。ICVD組3種基因型血清TLR2水平均高于對照組（F=11.43，P=0.005）。ICVD組及對照組TT型和TC型TLR2水平分別高于CC基因型（F=4.43，P= 0.021），但TT型和TC型血清TLR2水平比較差異無統計學意義（F=2.44，P=0.065）。見圖2～4。

圖2　各組基因型的血清LDL水平比較（±s）

2.5兩組的血清TLR2水平比較

ICVD組血清TLR2水平（5.0±2.6）ng/ml高于對照組（3.33±1.67）ng/ml，差異有統計學意義（t=3.488，P<0.01）。相關性分析結果顯示ICVD組血清TLR2與血清LDL水平呈正相關（r=0.801）。見圖5、6。

圖3　各組基因型的血清TC水平比較（±s）

圖4　各組基因型的血清TLR2水平比較（±s）

圖5　兩組血清TLR2水平比較（±s）

圖6　ICVD組血清TLR2與血清LDL水平相關性

3 討論

腦梗死是中老年人的常見病及多見病，隨著人口老齡化，腦梗死的發病率呈上升趨勢[7]，動脈粥樣硬化是ICVD病發生的重要病理基礎[8]，而血脂異常會引起心臟及大血管動脈粥樣硬化[7]。高濃度LDL血癥和高膽固醇血癥與動脈粥樣硬化密切相關，大腦內部或外部的血脂異?；虼x紊亂可能是ICVD發生的始動因素[9]。有研究顯示，腦梗死的發生與動脈粥樣硬化的程度成正相關[7]。本研究結果顯示，ICVD患者的血清LDL和TC水平明顯高于對照組。由此提示，血清LDL和TC水平與ICVD的發病密切相關。其機制可能為：①腦動脈血管壁上LDL的大量積聚，增加巨噬細胞對LDL的攝取，促進泡沫細胞的形成，增加腦動脈粥樣硬化發生的風險[10]。②高濃度的LDL激發體內的氧化應激發應，經氧化修飾后，通過細胞毒性作用、化學趨化作用，影響血管平滑肌增殖，加速泡沫細胞形成，影響纖溶和凝血等機制促進腦動脈粥樣硬化的形成和發展[11-12]，從而介導ICVD的發生。③正常情況下，LDL被細胞攝取后，經胞內溶酶體降解成TC，為組織所利用。當細胞內的TC達到一定量后，細胞啟動TC逆轉運機制，將多余的TC隨血液循環至肝臟，實現代謝平衡[13]。但當LDL水平過高或代謝障礙時，TC的代謝平衡也被打破，細胞內TC增多，會造成細胞內的脂質沉淀、泡沫細胞形成，循環中TC增多，會導致高膽固醇血癥、TC淤積和血管壁黏附，促進腦動脈粥樣硬化的形成和ICVD的發生[14]。

LDLR是介導LDL功能的關鍵效應分子，主要功能是結合LDL將其攜帶的脂類內吞入細胞降解，維持血漿膽固醇水平恒定[15]。由此提示，LDLR可能參與ICVD的發生。

rs688基因位于LDLR基因外顯子12上，與LDLR外顯子12剪接效率降低有關[16]。有研究顯示，rs688T等位基因與動脈粥樣硬化性疾病密切相關[17]。本研究采用PCR擴增結合基因測序技術檢測LDLRrs688基因多態性，結果顯示，ICVD組與對照組LDLRrs688 3種基因型頻率比較差異有統計學意義。等位基因頻率分析顯示，ICVD組LDLRrs688的T等位基因頻率高于對照組，由此進一步證實，LDLRrs688的T等位基因是ICVD發病的易感基因。與此同時，本研究結果還顯示LDLRrs688的TT型和TC型LDL、TC水平分別高于CC基因型，而TT型和TC型比較，差異無統計學意義。由此提示，LDLRrs688的T等位基因突變是引起血清LDL、TC水平升高的關鍵因素。LDLRrs688TT型和TC型基因型可能與ICVD的發病密切相關。

另有研究顯示，LDL影響血清TLR2的激活和表達，血清中LDL濃度增高或者被修飾引起內皮細胞損傷，內皮細胞損傷后產生的內源性配體激活可造成TLR2活性高表達[18]。活化的TLR2可使動脈內膜增厚，促進泡沫細胞形成，增加動脈粥樣硬化病變面積[19]。本研究結果顯示，ICVD組的血清TLR2水平明顯高于對照組，且與血清LDL水平呈正相關。由此可提示，TLR2與LDL可能存在正反饋的調節機制，而ICVD的發生可能正是由于這種調節機制過度活化的結果。本研究結果進一步顯示，LDLR rs688的TT型和TC型TLR2水平高于CC基因型，而TT型和TC型比較，差異無統計學意義。由此可以推測，ICVD患者高水平的TLR2的發生可能與LDLRrs688基因突變有關，但具體機制尚需進一步闡明。

高LDL、TC血癥是導致ICVD發生的獨立危險因素。而LDLRrs688的T等位基因是ICVD發病的易感基因，此基因突變可能通過上調血清LDL、TC、TLR2水平進而介導ICVD的發生。值得關注的是，TLR2與LDL之間存在的正反饋調節機制的過度活化，可能是介導ICVD發生的重要因素。

[1]顧向明,黃階勝,李瑩瑩,等.血清同型半胱氨酸與C反應蛋白在急性腦血管病診斷中的應用[J].檢驗醫學,2015,30(4):337-340.

[2]LANTZ M,SJ?STRAND C,KOSTULAS K.Ischemic stroke and patent foramen ovale:risk factors and genetic profile[J].Stroke Cerebrovasc Dis,2013,22(6):841-845.

[3]SAPOSNIK G,FONAROW G C,PAN W,et al.Guideline-directed low-density Lipoprotein management in high-risk patients with ischemic stroke:findings from get with the guidelines-stroke 2003 to 2012[J].Stroke,2014,45(11):3343-3351.

[4]GO A S,MOZAFFARIAN D,ROGERV L,et al.Executive Summary:heart disease and stroke statistics-2013 Update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2013, 127(1):143-152.

[5]CANOUí-POITRINE F,LUC G,BARD J M,et al.Relative contribution of lipids and apolipoproteins to incident coronary heart disease and ischemic stroke:the prime study[J].Cerebrovasc Dis, 2010,30(3):252-259.

[6]STEIN E A,RAALF J.Insights into PCSK9,low-density lipoproteinreceptorandlow-densitylipoproteincholesterol metabolism:of mice and man[J].Circulation,2013,127(24):2372-2374.

[7]王春霞,張鐵華.急性腦梗死患者血清同型半胱氨酸、尿酸及血脂水平的變化[J].檢驗醫學,2015,30(3):303-304.

[8]LIPSKA K,SYLAJA P N,SARMA P S,et al.Risk factors for acute ischaemic stroke in young adults in South India[J].Neurol Neurosurg Psychiatry,2007,78(9):959-963.

[9]LEE J D,LIN Y H,HUANG Y C,et al.Genetic polymorphisms of low density lipoprotein receptor can modify stroke presentation[J]. Neurol Res,2010,32(5):535-540.

[10]CAMPBELL D J,NEAL B C,CHALMERS J P,et al.Low-density lipoprotein particles and risk of intracerebral haemorrhage in subjects with cerebrovascular disease[J].Eur JCardiovasc Prev Rehabil,2007,14(3):413-418.

[11]HERMSDORFF H H,PUCHAU B,VOLP A C,et al.Dietary total antioxidant capacity is inversely related to central adiposity as well as to metabolic and oxidative stress markers in healty young adults[J].Nutrition&Metabolism,2011,150(8):48-59.

[12]OSORIO A,ORTEGA E,DE HARO T,et al.Lipid profiles and oxidative stress parameters in male and female hemodialysis patients[J].Mol Cell Biochem,2011,353(11):59-63.

[13]BEAVEN S W,TONTONOZP.Nuclear receptors in lipid metabolism:targeting the heart of dyslipidemia[J].Annu Rev Med, 2006,57:313-329.

[14]GOLDSTEIN M R,MASCITELLI L.Hemorrhagic stroke in the stroke prevention by aggressive reduction in cholesterol levels study[J].Neurology,2009,72(16):1448-1459.

[15]SLIMANI A,JELASSI A,JGUIRIM I,et al.Effect of mutations inLDLRandPCSK9genesonphenotypicvariabilityin Tunisian familial hypercholesterolemia patients[J].Atherosclerosis, 2012,222(1):158-166.

[16]ZHU H,TUCKER H M,GREAR K E,et al.A common polymorphism decreases low-density lipoprotein receptor exon 12 splicing efficiency and associates with increased cholesterol[J]. Hum Mol Genet,2007,16(14):1765-1772.

[17]MARTINELLI N,GIRELLI D,LUNGHI B,et al.Polymorphisms at LDLR locus may be associated with coronary artery disease through modulation of coagulation factorⅧactivity and independently from lipid profile[J].Blood,2010,116(25):5688-5697.

[18]TOMOFUJI T,EKUNI D,AZUMA T,et al.Involvement of toll-like receptor 2 and 4 in association between dyslipidemia and osteoclast differentiation in apolipoprotein Edeficient rat periodontium[J].Lipids Health Dis,2013,12(1):1-9.

[19]HASU M,THABET M,TAM N,et al.Specific loss of toll-like receptor 2 on bone marrow Derived cells decreases atherosclerosis in LDL receptor null mice[J].Can J Physiol Pharmacol, 2011,89(10):737-742.

（申海菊編輯）

Correlation ofLDLRgene rs688 polymorphisms with ischemic cerebrovascular disease*

Na Li1，Wei Zheng2，Xiao-fang Hu2
（1.Graduate School，Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning，121001，China；2.Clinical Laboratory，General Hospital of Shenyang Military Command，Shenyang，Liaoning 110016，China）

Objective To investigate the relationship between low-density lipoprotein receptor（LDLR）gene rs688 polymorphism with ischemic cerebrovascular disease（ICVD）.Methods TheLDLRgene rs688 polymorphism for 264 ICVD patients（ICVD group）and 180 healthy people（control group）were detected by PCR and direct nucleotide sequencing analysis.Meanwhile，the serum levels of LDL，TC，and Toll-like receptor 2（TLR2）were detected in all the groups.Results The genotype distribution ofLDLRrs688 and the frequency of T allele had significant differences between the ICVD and the control groups（P＜0.05）.Serum LDL and TC levels in the patients with CC genotype were obviously lower than those in the patients with TT and TC genotypes（P＜0.05）.But serum LDL and TC levels had no significant differences between the patients with TT and TC genotypes（P＞0.05）.Serum LDL，TC and TLR2 levels in the ICVD group were significantly higher than those in the control group（P＜0.01）.Meanwhile，correlation analysis showed that serum TLR2 level was positively correlated with LDL level in the ICVD group（r=0.801，P＜0.05）.Conclusions High levels of serum LDL and TC are independent risk factors for ICVD.T allele ofLDLRrs688 is a susceptible gene ofICVD.The polymorphism ofLDLRgene rs688 is a genetic risk factor of elevating the serum levels of LDL and TC.High level of serum TLR2 is closely associated with occurrence of ICVD.

low-density lipoprotein receptor；ischemic cerebrovascular disease；gene polymorphism

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.007

1005-8982（2016）19-0032-05

2015-11-09

遼寧省自然科學基金（No：201102240）

胡曉芳，E-mail：hxf630212@msn.com.cn