在線固相萃取-毛細(xì)管高效液相色譜聯(lián)用測定奶酪中的生物胺

楊姍姍　楊亞楠　李雪霖　張燕

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津300457)

在線固相萃取-毛細(xì)管高效液相色譜聯(lián)用測定奶酪中的生物胺

楊姍姍楊亞楠李雪霖張燕*

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津300457)

采用雙二元泵毛細(xì)管液相色譜，通過六通閥實(shí)現(xiàn)了樣品的在線凈化與分離定量的自動切換，建立了同時測定奶酪中的15種生物胺的在線固相萃取-毛細(xì)管高效液相色譜聯(lián)用方法。通過優(yōu)化毛細(xì)管高效液相色譜的分離條件，考察在線固相萃取流動相的組成、上樣溶液pH值以及六通閥的切換時間對生物胺回收率的影響，確定最佳分析條件為:5%乙腈-水作為固萃柱(Zorbax SB-C18)的流動相，上樣溶液pH=11，上樣3 min后切換六通閥。采用內(nèi)標(biāo)法定量，15種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0．25～50．0 mg/L，檢出限(LOD)為0．05～0．25 mg/L，定量限(LOQ)為0．15～0．80 mg/L。除了甲胺、乙胺、3-甲基丁胺和5-羥基色胺外，其余生物胺的不同添加水平(1，20和40 mg/kg)下的加標(biāo)回收率為79．6%～118．7%;除3-甲基丁胺和5-羥基色胺外，其余生物胺的RSD在0．3%～14．9%之間，可用于奶酪中多種生物胺的快速檢測。

在線固相萃取;毛細(xì)管高效液相色譜;生物胺;奶酪

1　引言

生物胺是一類低分子量的堿性含氮有機(jī)物，是生物活細(xì)胞中不可缺少的活性組分［1］，廣泛存在于各類食品中，尤其是富含蛋白質(zhì)的食品和發(fā)酵類食品。然而，當(dāng)大量攝入或自身解毒能力不足時，就會對人體的神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成傷害，甚至危及生命。其中，組胺的毒性最大。動物機(jī)體內(nèi)的二胺氧化酶及組胺轉(zhuǎn)甲基酶都可降解組胺，而腐胺和尸胺可抑制這兩種酶的代謝作用，從而增強(qiáng)組胺的毒性，且這兩種胺能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生亞硝胺，具有潛在的致癌性［2］。生物胺主要是由于微生物產(chǎn)生的脫羧酶［3］使氨基酸脫羧生成的，因此生物胺含量與微生物污染程度有關(guān)，成為食品新鮮度的評價指標(biāo)。干酪含有豐富的氨基酸，在長期的發(fā)酵過程中如果有腐敗微生物污染［4］，則會產(chǎn)生大量生物胺，存在安全風(fēng)險?；谏锇肪哂械陌踩：π约白鳛槭称沸迈r度評價指標(biāo)的重要性［5，6］，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的生物胺檢測方法具有重要意義。

目前，食品樣品中生物胺的檢測方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)［7～10］、高效液相色譜法［11～13］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［14，15］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［16～18］、離子色譜法［19～21］、薄層色譜法［22～24］以及電泳法［25，26］等。文獻(xiàn)中多采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，用液/液萃取或離線固相萃取進(jìn)行富集凈化［27～29］。但是都需要手工操作，重現(xiàn)性較差;花費(fèi)時間較多，降低了樣品前處理效率;耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，且固相萃取柱為一次性使用，成本高。張國梁等［30］采用離線固相萃取的方式，利用高效液相色譜建立了測定干酪中的6種生物胺，本研究采用在線固相萃取的方式，簡化了樣品的前處理操作，減少了手工操作的誤差;孫寧等［31］建立了高效液相色譜檢測干酪中的5種生物胺，而本方法通過優(yōu)化色譜分離條件，可以實(shí)現(xiàn)15種生物胺的分離與定量分析，提高了分析效率。

本研究通過對毛細(xì)管液相色譜條件的優(yōu)化，建立了奶酪中生物胺的準(zhǔn)確、快速的檢測方法。采用在線固相萃取進(jìn)行樣品的凈化，提高了分析效率，顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了檢測的準(zhǔn)確度。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2．1儀器與試劑

Agilent 1200系列毛細(xì)管高效液相色譜儀，配有兩個雙元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、六通閥、DAD檢測器(美國Agilent公司);UC-6200超聲儀(美國美瑞泰克公司);5804R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。固相萃取柱Zorbax SB-C18柱(35 mm×0．5mm，5μm)，分析柱Zorbax SB-C18柱(150mm×0．5mm，5μm)均購自美國Agilent公司;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(美國Millipore公司);IKA MS3渦旋振蕩儀(德國IKA公司);MA-4ACE破碎勻漿儀(日本Nihonseiki Kaisha公司)。

甲胺鹽酸鹽(Methylamine hydrochloride)、乙胺鹽酸鹽(Ethylamine hydrochloride)、色胺(Tryptamine)、丁胺(Butylamine)、苯乙胺(Phenylethylamine)、3-甲基丁胺(3-methylbutanamine)、戊胺(Amylamine)、腐胺二鹽酸鹽(Putrescine dihydrochloride)、尸胺二鹽酸鹽(Cadaverine dihydrochloride)、組胺二鹽酸鹽(Histamine dihydrochloride)、章魚胺(Octopamine)、5-羥基色胺鹽酸鹽(5-hydroxy-tryptamine hydrochloride)、酪胺(Tyramine)、精胺(Spermidine)、亞精胺(Spermine)、1，7-二氨基庚烷(1，7-Diaminoheptane)、丹磺酰氯(Dansyl chloride)，均購自美國Sigma-Aldrich公司;乙腈(HPLC級，美國Merck公司)。

2．2標(biāo)準(zhǔn)溶液及衍生試劑的配制

生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:準(zhǔn)確稱取各種生物胺10．00 mg，用0．1 mol/L HCl定容至10 mL，配制成1000 mg/L的生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃保存?zhèn)溆茫褂们?，?．1 mol/L HCl將生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至適當(dāng)濃度的中間工作液、標(biāo)準(zhǔn)工作液以及混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

丹磺酰氯溶液(5 mg/mL):稱取250 mg丹磺酰氯，以丙酮溶解并定容至50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2．3樣品前處理

稱取5．00 g奶酪，加200μL 100 mg/kg的內(nèi)標(biāo)物1，7-二氨基庚烷，用破碎勻漿儀將奶酪粉碎，加入10 mL甲醇，蝸旋振蕩1 min，超聲提取30 min，于4℃，10000 g離心10 min，將上清液過濾，剩余的殘?jiān)僦貜?fù)提取一次，合并兩次所得的上清液，在40℃下減壓蒸干后用1 mL 0．1 mol/L HCl復(fù)溶，待衍生。

2．4生物胺的衍生

取生物胺的標(biāo)準(zhǔn)工作液或樣品提取液1 mL于5 mL容量瓶中，加入200μL 2 mol/L NaOH、300μL飽和NaHCO3溶液，混合均勻后加入4 mL 5 mg/L丹磺酰氯溶液，混合均勻，在60℃水浴中加熱15 min，每隔5 min混勻一次，衍生完成后，立即加入200μL 25%(m/m)氨水，以除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，靜置20 min后，40℃下氮吹至5 mL，此時pH=11。

2．5在線固相萃取的流程

基于Agilent1200系列的毛細(xì)管液相色譜的雙二元泵系統(tǒng)，分析流程如圖1所示。初始閥的位置為1-2，樣品在固相萃取柱上在線凈化，然后通過六通閥切換，閥位置為1-6相連，此時，固相萃取柱與分析柱相串聯(lián)，泵2的流動相將固相萃取柱上的目標(biāo)物反沖至分析柱上，進(jìn)行分離檢測。

2．6色譜條件

在線固相萃取(On-line SPE):固相萃取柱Zorbax SB-C18柱(35 mm×0．5 mm，5μm);5%乙腈-水為流動相等度洗脫，流速10μL/min;進(jìn)樣體積1μL;六通閥的切換時間見表1。

分析:分析柱 Zorbax SB-C18柱(150 mm× 0．5 mm，5μm);流動相為超純水和乙腈;流速10μL/min;柱溫35℃;檢測波長為245 nm;梯度洗脫條件見表1。

3　結(jié)果討論

3．1色譜分離條件的選擇

選擇對堿性物質(zhì)具有良好保留特性和分離能力的SB-C18色譜柱作為分析柱，對生物胺進(jìn)行分離，分別采用乙腈-水(含10 mmol/L乙酸銨)、乙腈-水(含10 mmol/L K2PO4)、乙腈-水(含5 mmol/ L乙酸銨和5 mmol/L K2PO4)、乙腈-水作為分析柱的流動相，進(jìn)行梯度洗脫條件優(yōu)化。結(jié)果表明，上述體系均能使目標(biāo)物得到很好的分離，但是乙腈-水體系加入乙酸銨，目標(biāo)物的響應(yīng)值降低;加入K2PO4對大部分生物胺的響應(yīng)值有所提高，但是會抑制亞精胺、精胺的響應(yīng)值;加入兩種鹽的混合體系，顯著抑制了精胺的響應(yīng)值。因此，選用乙腈-水體系為分析柱的流動相，進(jìn)一步優(yōu)化了流動相的梯度洗脫程序、流動相的pH值、流速及柱溫等色譜分離條件，已達(dá)到最佳的分離效果和靈敏度。

表1　在線固相萃取梯度洗脫程序及閥切換時間Table 1　Gradient program of online solid phase extraction and valve switching

15種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品在優(yōu)化后的色譜分離條件下分析得到的色譜圖見圖2。

圖2　15種生物胺的色譜分離圖Fig．2　Chromatogram of 15 biogenic amines(BAs) 1．甲胺;2．乙胺;3．色胺;4．丁胺;5．苯乙胺;6．3-甲基丁胺; 7．戊胺;8．腐胺;9．尸胺;10．組胺;11．章魚胺;12．5-羥基色胺;13．酪胺;14．亞精胺;15．精胺;IS．內(nèi)標(biāo)。1．Methylamine;2．Ethylamine;3．Tryptamine;4．Butylamine; 5．2-phenylethylamine;6．3-methylbutanamine;7．Amylamine; 8．Putrescine;9．Cadaverine;10．Histamine;11．Octopamine; 12．5-hydroxytryptamine;13．Tyramine;14．Spermidine;15．Spermine;IS:Internal standard．

3．2在線固相萃取條件的優(yōu)化

分別改變在線固相萃取的流動相，上樣溶液pH值以及閥切換時間，采用建立的毛細(xì)管液相色譜方法測定不同固相萃取條件下洗脫得到的生物胺含量，以生物胺回收率(測得的生物胺量除以上樣量所得百分?jǐn)?shù))評價生物胺在固相萃取柱上的吸附程度。

在線固相萃取的流動相起著活化固萃柱的作用，同時對目標(biāo)物在固萃柱上的吸附及雜質(zhì)的分離起著重要作用。采用等度洗脫方式，分別以5%，10%，15%和20%的乙腈-水為流動相，考察了生物胺在固萃柱上的吸附行為。結(jié)果表明，隨著乙腈濃度的增大，生物胺的損失增大。這是由于上樣過程中高濃度有機(jī)溶劑減小了固相萃取柱對生物胺的吸附，增加了對生物胺的洗脫力，因此，洗脫至分析柱上的生物胺減少，造成回收率降低。5%乙腈-水為流動相時，生物胺的回收率達(dá)到82．2%～128．8%，因此選擇5%乙腈-水溶液為固相萃取柱的流動相。

上樣溶液pH值影響生物胺衍生物的存在狀態(tài)，進(jìn)而影響生物胺在固萃柱上的吸附行為，從而可能會影響生物胺的保留時間以及儀器的響應(yīng)值。因此進(jìn)一步研究了上樣溶液pH值(8，9，10，11和12)對生物胺回收率的影響。結(jié)果表明，pH=8時，5-羥基色胺、精胺的RSD均大于15%，這可能是因?yàn)樵诖藀H值下，5-羥基色胺與精胺的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，造成了檢測結(jié)果的偏差較大;pH=9時，精胺回收率僅為67．59%，損失嚴(yán)重，可能是由于精胺的特殊結(jié)構(gòu)造成，該衍生條件下精胺的兩個仲胺可能未被丹磺酰氯衍生，仲胺在pH 9時極性較強(qiáng)，減弱了精胺衍生物在固萃柱上的吸附力;pH=10時，戊胺回收率高達(dá)151．4%;pH=12時，甲胺、色胺、苯乙胺的回收率均大于130．8%，可能是因?yàn)樵損H值下，不同生物胺的儀器響應(yīng)值均不同程度增加，造成個別生物胺測定結(jié)果偏高;pH=11時，各種生物胺的回收率為87．8%119．8%，RSD為4．4%～9．0%，回收率和重現(xiàn)性均較好。因此，選擇上樣溶液的pH=11。

考察了上樣后閥切換時間(1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5和4．0 min)對生物胺回收率的影響。時間越短，生物胺的回收率越低，這是因?yàn)榍袚Q時間短，固相萃取柱未捕集到全部的分析物，閥切換后，未流經(jīng)固相萃取柱的分析物流入廢液，導(dǎo)致上樣不完全，造成回收率降低。隨著閥切換時間延長，生物胺的回收率逐漸升高，但是閥切換的時間(4．0 min)過長，就會將吸附到固萃柱的生物胺重新洗脫下來而排入廢液，造成損失。因此，選擇3 min為最佳的閥切換時間。

15種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品在優(yōu)化后的在線固萃和色譜分離條件下分析得到的色譜圖見圖3。

圖3　15種生物胺的在線固相萃取與毛細(xì)管液相聯(lián)用的色譜分離圖Fig．3　Chromatogram of 15 BAs using on-line SPE combined with capillary HPLC圖中峰號同圖1。The peak numbers are the same as in Fig．2．

3．3方法的線性范圍與檢出限及定量限

取不同濃度的15種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，經(jīng)丹磺酰氯衍生后，利用優(yōu)化后條件檢測，以生物胺的濃度為橫坐標(biāo)，各個生物胺衍生物的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明(表2)，15種生物胺在0．25～50．0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0．9981。逐漸稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行測定，峰高為3倍噪聲時對應(yīng)的標(biāo)品濃度為檢出限(LOD)，定量限(LOQ)為能夠準(zhǔn)確進(jìn)行定量的最低濃度(RSD＜15%)。在本方法對15種生物胺的檢出限為0．05～0．25 mg/L，定量限為0．15～0．80 mg/L。

表2　15種生物胺的on-line SPE與毛細(xì)管高效液相色譜聯(lián)用的檢測方法的分析特征量Table 2　Analytical characteristic data of the on-line SPE combined microcolumn HPLCmethod for the determination of 15 BAs

3．4奶酪實(shí)際樣品和回收率的測定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，從超市中購買了兩種進(jìn)口奶酪和兩種國產(chǎn)奶酪，共4種樣品，每種樣品均設(shè)不添加、添加1，20和40 mg/kg濃度水平的15種生物胺標(biāo)品，添加200μL 100 mg/kg的內(nèi)標(biāo)，采用本方法進(jìn)行測定(表3)。圖4是某國產(chǎn)奶酪的色譜圖。結(jié)果表明，4種樣品中均檢出不同種類及含量的生物胺，其中，4種樣品均檢測到甲胺、色胺、戊胺、腐胺、亞精胺、精胺，3種樣品檢測到苯乙胺、尸胺和酪胺，2種樣品檢測到了乙胺、丁胺、3-甲基丁胺、5-羥基色胺、組胺，只有1種樣品檢測到了章魚胺。

除甲胺、乙胺、3-甲基丁胺和5-羥基色胺的測定結(jié)果偏差稍大外，其余生物胺的加標(biāo)回收率在79．65%～118．66%之間;除3-甲基丁胺和5-羥基色胺外，RSD值在0．3%～14．9%范圍內(nèi)，表明本方法有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可以用于實(shí)際樣品中15種生物胺的同時分析檢測。

表3　奶酪中生物胺的含量及不同添加濃度下的平均回收率(%，RSD，n=3)Table 3　BAs contents in cheese samples(mg/kg)and recovery of cheese samples at different spiked levels(%，RSD)

續(xù)表3　(Continued to Table 3)

圖4　國產(chǎn)奶酪1的在線固相萃取-毛細(xì)管液相色譜聯(lián)用測定的色譜圖Fig．4　Chromatogram of Domestic cheese 1 samples by on-line SPE combined with capillary HPLC 1．甲胺;2．乙胺;3．色胺;4．丁胺;7．戊胺;8．腐胺;9．尸胺;14．亞精胺;15．精胺;IS．內(nèi)標(biāo)。1．Methylamine;2．Ethylamine;3．Tryptamine;4．Butylamine; 7．Amylamine;8．Putrescine;9．Cadaverine;14．Spermidine; 15．Spermine;IS:Internal standard．

4　結(jié)論

本研究建立了在線固相萃取與毛細(xì)管液相色譜聯(lián)用同時測定奶酪中15種生物胺的分析方法，通過優(yōu)化在線固相萃取的關(guān)鍵參數(shù)及色譜分離條件，提高了分析方法的精密度重現(xiàn)性及分析效率。本研究為食品中生物胺的快速分析提供了新的技術(shù)手段。

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31SUN Ning，ZHAO Huai-Xin．China Dairy Industry，2008，36(7):50－53孫寧，趙淮新．中國乳品工業(yè)，2008，36(7):50－53

Thiswork was supported by the National High Technology Research and Development Program of China(No．2011AA100807)．

Determination of Biogenic Am ines in Cheese by On-line Solid Phase Extraction Coupled with Capillary High Performance Liquid Chromatography

YANG Shan-Shan，YANG Ya-Nan，LIXue-Lin，ZHANG Yan*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

An on-line solid phase extraction coupled with capillary HPLC method was established for the simultaneous determination of fifteen kinds of biologic amines in cheese．The biogenic amines were concentrated on the solid phase extraction column，and transferred by the six-way valve to analytical column for separation and detection．Separation conditions on capillary HPLC，composition of on-line SPE mobile phase，pH of the sample solution and switching time of six-way switching valve were investigated to get better separation conditions of15 biogenic amines．Optimum on-line SPE conditions including 5%of the acetonitrilewater asmobile phase for SPE column，pH=11 of the sample solution and 3min of valve switching time were employed in the analyticalmethod．The linear range of standard curve for fifteen biogenic amineswas0．25－50．0 mg/L;LOD werewithin the range of0．05－0．25mg/L．At spiked levels of1，20，40 mg/kg，the recoveries of fifteen biogenic amines on four kinds of cheese ranged from 79．6%to 118．7%except methylamine，ethylamine，3-methylbutanamine and 5-hydroxytryptamine;with RSDs from 0．3%to 14．9%except 3-methylbutanamine and 5-hydroxy-tryptamine．Themethod is accurate and reliable，and can be used to detect biogenic amines in cheese．

On-line solid phase extraction;Capillary high performance liquid chromatography;Biogenic amines;Cheese

15 October 2015;accepted 23 November 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150811

2015-10-15收稿;2015-11-23接受

本文系國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃基金資助項(xiàng)目(863計劃，No．2011AA100807)

*E-mail:yzhang@tust．edu．cn