高分辨飛行時間質譜在蛋白質組學相對定量分析中的應用

洪曉愉王浩徐金玲李水明王勇*(深圳大學生命科學學院，微生物工程重點實驗室，深圳58060)(深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室，深圳58060)

高分辨飛行時間質譜在蛋白質組學相對定量分析中的應用

洪曉愉1王浩1徐金玲1李水明2王勇*2
1(深圳大學生命科學學院，微生物工程重點實驗室，深圳518060)2(深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室，深圳518060)

利用TripleTOF 5600高分辨質譜儀分析牛血清白蛋白等3種蛋白質標準品，研究了質譜離子強度與蛋白質樣品相對含量的相關性。蛋白質標準品用胰酶酶切后，稀釋成1～1024 fmol/7μL的系列溶液，考察在1～1024 fmol上樣量情況下，肽段的前體離子計數(cps)、蛋白質全部肽段的離子計數之和以及被檢出肽段數目與上樣量的相關性，以及相同樣品在3次平行實驗之間這些數值的變化幅度。結果表明。被檢出肽段數目與上樣量正相關，當cps超過1000時，所有肽段離子強度之和與上樣量呈線性關系，但是用最靈敏肽段的離子強度表示更為準確。3次測量同一肽段的最高離子強度通常不會超過最低強度的1．5倍，提示當不同樣品中同一蛋白的離子強度相差3倍以上是判斷不同樣品中相同蛋白質的含量具有差異的可靠閾值。本研究提供了一種利用高分辨率和高掃描速度蛋白質組組學定性數據進行半定量分析的方法，簡便、快速，可為相關生物學和醫學研究提供參考。

定量蛋白質組學;高分辨飛行時間質譜;打擊計數;信號強度;無標記定量

1　引言

了解特定生物學過程，不僅要知道所涉及的分子種類，還需要明晰它們的含量及動態變化。具有高通量、高靈敏度、高線性范圍和較高準確度的定量蛋白質組學近年來發展迅速，在生物學和醫學研究中的應用日益廣泛［1～4］。按照不同的定量原理，定量蛋白質組學技術可分為依據凝膠成像和液相色譜-質譜信號強度兩種定量技術。前者主要利用雙向電泳(銀染或考染)或雙向熒光差異凝膠電泳(DIGE)［5］，在蛋白質水平上進行定量分析，蛋白質的定量和序列鑒定是兩個獨立的步驟，其優點是差異蛋白被真正分離，并且更為直觀，但是操作繁瑣耗時，各種翻譯后修的存在使得“單一”蛋白點上有可能是分子量和等電點非常接近的蛋白質的混合物。隨著多維液相色譜-質譜技術和數據處理軟件的不斷發展，基于質譜的定量蛋白質組學技術逐漸成為該領域的主流技術。

基于質譜的定量分析是將蛋白質通過特異性酶切水解成適于質譜檢測的肽段，在進行肽段序列鑒定的同時提取質譜信號的強度信息，然后將來自肽段的定量信息還原成蛋白質的定量信息。根據定量分析目的，又分為以三重四級桿質譜為平臺的絕對定量分析(SRM)［6］和在其它串聯質譜上實現的相對定量分析［7］。絕對定量分析是對已知蛋白和肽段的靶向測定，靈敏度高，抗干擾性強，但通量較小并需要合成目標肽段。目前應用更為廣的方法是在高分辨質譜上同時實現蛋白質的鑒定和定量分析，按照定量分析策略，后者又可分為穩定同位素標記定量分析［8］和無標記定量分析［9］兩類［10～12］。典型的標記定量分析方法有兩種:需要含同位素標記的細胞培養基(SILAC)［13］和需要增加蛋白質處理步驟的iTRAQ［14］方法，雖然成本較高，但由于其穩定性和準確性較高，目前被許多研究者在發現蛋白質組學中所采用。非標定量分析方法包括信號強度法和譜圖計數法，其在實驗操作上與定性分析相似，但要求復雜的數據提取和處理方法［15］，并且每個樣品需至少平行測定3次，以消除各種偶然誤差，耗時較長。SILAC和iTRAQ分別根據一級和二級質譜信號進行定量分析。近年來，根據三級串聯質譜信號定量分析和各種非數據依賴型采集方法的發展很快［16］。

但是，在一些生物學項目中，研究者也希望根據單次的蛋白質組學定性實驗結果，得到某些目標蛋白含量的粗略比較，為下一步實驗提供研究方向和決定是否進行定量分析蛋白質組學分析。因此，如果在蛋白質組的定性鑒定實驗中提取出半定量分析信息，將有助于滿足這樣的實驗需求。在Protein-pilot搜庫軟件輸出的肽段匯總列表中，除肽段序列、誤差和保留時間等指標外，還包括前體離子強度的信息，即總打擊計數(counts)，它是通過對色譜峰上所有采樣點的數據求和所得。為便于不同實驗條件的比較，該值以每秒打擊計數(cps)的形式表示，如果該離子被多次掃描，在刪除重復項之后，系統會留下最高值。無標記定量分析中通常采用色譜峰的峰面積定量分析，但需要對每個肽段逐一進行提取，而利用cps的優勢在于該值可自動輸出，方便快捷。用該值近似表示肽段含量涉及以下問題:(1)由于是定性鑒定實驗，一級譜掃描時間較短，取點較少，保留時間的微小變化可能對結果產生較大影響，因此需進行平行實驗;(2)需證明前體離子信號強度與蛋白質含量是否線性相關;(3)需考察單一肽段的離子強度和所有肽段離子強度之和哪一種更為準確及適用條件;(4)被檢測肽段數目如何隨蛋白質濃度變化。基于以上問題，本研究將3種標準蛋白質按照濃度呈2～4倍的增加梯度配成10-10～10-7mol/L的蛋白質標準溶液，每個樣品濃度重復測定3次，考察3次平行實驗中肽段強度的變化幅度及被檢測肽段數量、單一肽段強度及所有肽段強度之和與蛋白質濃度的關系，分析上述指標的影響因素，為利用不同樣品單次測定的質譜強度(cps值)半定量分析比較蛋白質相對含量的可能性和應用條件提供實驗依據。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

Eksigent nanoLC-UltraTM2D二維納升液相色譜系統、TripleTOF 600高分辨質譜儀、Protein Pilot 4．5軟件(AB SCIEX，美國);真空冷凍干燥機(Thermo Savant，美國)。

牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、溶菌酶C(LYZC)和胰蛋白酶(Sigma公司);其它試劑至少為分析純;實驗用水為超純水(18．2 MΩcm)。

2．2樣品處理

稱取1．00 mg各種蛋白粉末，分別加入25 mmol/L NH4CO3配制成1 mg/mL蛋白溶液，按照蛋白與酶質量比為40∶1的比例加入胰酶，在37℃水浴酶切16 h，最后將得到的酶切液逐級稀釋，配制成1～1024 fmol/7μL的樣品。

2．3反相色譜‐Trip leTOF分析

將3種蛋白質的酶切液首先上樣到C18預柱(100μm×3 cm，3μm，15μm)上，上樣量7μL，流速2μL/min，沖洗脫鹽10min。分析柱為C18反相色譜柱(75μm×15 cm，3μm，120，ChromXP Eksigent)，流動相A為水-乙腈(含0．1%甲酸)(98∶2，V/V)，流動相B為乙腈-水(含0．1%甲酸)(98∶2，V/V)。梯度洗脫:0～2 min，5%B;2～18 min，5%～40%B;18～24 min，80%B;24～30 min，5%B。質譜分析采用TripleTOF 5600結合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2．4 kV，氣簾氣壓力為30 Psi，霧化氣壓力為5 Psi，加熱溫度為150℃，掃描方式為信息依賴的采集工作模式(Information dependent analysis，IDA)。

2．4數據分析

質譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot Software v．4．5(AB SCIEX，美國)軟件對3種蛋白質進行檢索分析，檢索參數設置為胰蛋白酶酶切和生物學修，假陽性率控制為1%FDR。

3　結果與討論

3．1標準品含量與檢出肽段數目的正相關性

離子信號強度和圖譜數目與蛋白質含量的關系的研究較多，發現蛋白質被檢測到肽段數目與其含量密切相關，因此在不同體系中的同一蛋白質，其肽段的檢出數目是其相對含量的一個最簡單指標。本研究考察BSA，OVA和LYZC在上樣量從1 fmol增至1 pmol過程中被檢測到的肽段數目的變化。如圖1A所示，BSA總量為1 fmol時，3次平行實驗測得肽段數目分別為1，1和3;BSA總量為2 fmol時，肽段數目為3，6和6;BSA總量繼續增加2倍(4 fmol)時，肽段數量變化不大，分別為5，5和6;但是當BSA總量繼續增加后，肽段數目均顯著增加;除在64和128 fmol有1次檢測到的肽段數均為26個外，在高含量組所檢測到的肽段數目總是高于低含量組，但在相同濃度組內具有一定偶然性。在溶菌酶C上也觀察到類似現象，即被檢測的肽段數目隨蛋白質含量增加(圖1B)，但含量起點升高，即在8 fmol含量時，在3次實驗中只有1次檢測到1個肽段，而從16 fmol增至64 fmol時，肽段數量增加并不明顯;從256 fmol增至1024 fmol時，肽段數目增加顯著。卵清蛋白的肽段數目隨濃度變化的趨勢(數據未給出)與溶菌酶C相近，在16 fmol時，有1個肽段檢出;含量高于128fmol時，檢出肽段數目顯著增加。以上結果表明，對同一蛋白質而言，在濃度超過一定閾值后，其被檢測到的肽段數目與它的量具有正相關性，該閾值應與蛋白質的種類、結構、其酶切肽段的化學性質和是否容易電離等因素有關。對于不同蛋白質不能簡單比對，但同一蛋白質在不同體系中被檢測到的肽段數目差異反映了其含量的不同。此外，肽段的前體離子強度還可提供進一步的半定量分析信息。

圖1　蛋白質上樣量對檢出肽段數目的影響Fig．1　Influence of protein amounts on the number of detected peptides (A)牛血清白蛋白(B)溶菌酶C。(A)Bovine serum albumin(BSA);(B)Lysozyme C(LYZC)．

圖2　牛血清白蛋白的標準曲線Fig．2　Standard curve for BSA A:1－1024 fmol;B:1－16 fmol．

3．2標準品上樣量與前體離子強度之和的相關性

用cps表示離子強度，考察了蛋白質所有檢出肽段的cps值之和與其含量的關系，首先驗證了3種蛋白質標準品的總離子強度之和與其上樣量間的關系。如圖2所示，BSA各肽段的離子強度之和在1～1024 fmol的上樣量范圍內與上樣量呈線性關系，回歸系數為0．985，但是在低上樣量(1～16 fmol)時線性關系不好，2與4 fmol的信號相近。此外，雖然3次平行測定實驗的標準偏差較大，但在上樣量的遞增過程中，所有梯度實驗的上樣量與離子強度信號之和都具有正相關性，即可以用BSA各肽段離子強度之和表示其含量。考慮到同一樣品信號強度的最高值與最低值之間的比值小于1．5倍，可以認為如果在不同樣品中某蛋白質的總肽段信號強度之和變化超過3倍(極差)，則可以忽略儀器在測定過程中色譜峰取點波動所產生的影響，認為含量有變化。對于卵清蛋白和溶菌酶C也觀察到了類似關系，但線性范圍較窄，重現性亦較差。

3．3單一肽段離子打擊數與上樣量的相關性

由以上的實驗結果和分析可知，蛋白質被檢測到的肽段數目與上樣量有關，所以使用肽段的離子強度之和表示蛋白質含量也會受到上樣量的影響。對于3種蛋白質標準品，所檢測到肽段的最小打擊數分別為152，164和175，進一步隨機分析其它樣品的數據，發現被檢測肽段的最低打擊數約為50，因此，打擊數150已接近能夠被檢測的極限，而只有打擊數大于1000時才開始呈現較強的濃度-信號強度之間的線性關系和較小的隨機誤差，而不同序列肽段質譜檢測的靈敏度不同，此結果表明，可以利用類似SRM的方法選擇最靈敏肽段進相對定量分析。

由圖3可見，以BSA為例，最先被檢測到的酶切肽段為LVNELTEFAK，并且在各組結果中其離子強度均為最高，在進樣量為1024 fmol時，該肽段離子強度約占總57條肽段的總離子強度的22%，用該肽段進行定量分析的效果優于使用離子強度之和，回歸系數為0．996。此外，肽段QTALVELLK的定量分析效果也較好，回歸系數為0．995。在溶菌酶C中，最靈敏和次靈敏肽段分別為GTDVQAWIR和NTDGSTDYGILQINSR，它們在上樣量256 fmol時cps值大于1000，線性范圍為256～1024 fmol。卵清蛋白的最靈敏肽段為LTEWTSSNVMEER，也是在256～1024 fmol時呈現穩定的線性范圍。以上結果說明，低濃度或低響應時，由于電離的隨機性和離子傳輸過程中的損失對響應信號的影響不可忽略，而在高濃度時這兩種影響的損失占總離子的比重較小，即可呈現較強的線性關系。此外，離心管和內插管等容器對蛋白質和多肽的吸附無法完全避免，在蛋白質和多肽濃度較低時這些因素對分析結果的影響相對較大。因此，如果蛋白質具有很靈敏的檢測肽段，用該肽段的離子強度表示蛋白質的含量更為準確。

圖3　肽段LVNELTEFAK和QTALVELLK的標準曲線Fig．3　Standard curves for peptide LVNELTEFAK and QTALVELLK

選擇肽段時應注意，蛋白質序列的多樣性也可能影響分析結果。例如，肽段QTALVELLK還會發生N端的焦谷氨酸化和絲氨酸的脫水以及胰酶漏切肽段KQTALVELLK，而肽段KQTALVELLK還會發生N端的甲酰化、乙酰化和氨甲酰化，這種序列的多樣性對酶解過程的平行性和酶的質量穩定性提出了更高要求。此外，有些肽段在濃度較高時還會發生鈉離子化［17］。本方法不適于低質譜響應的蛋白和肽段，在采用非數據依賴性采集技術，如全部理論碎片離子的連續窗口采集(SWATH)技術［18］，有可能對這些肽段更為有效，但SWATH技術要求4次質譜分析，也比較耗時。本研究表明，對于低濃度和低質譜響應肽段，無論采用哪種標記或非標定量分析方法，都無法完全避免生物學吸附和質譜分析過程中的不確定性。

4　結論

利用TripleTOF 5600高分辨質譜儀，分析牛血清白蛋白等3種蛋白質標準品，研究了質譜離子強度與蛋白質樣品相對含量的相關性。結果表明，蛋白質濃度或上樣量的增加與肽段檢出數量、肽段cps數和總肽段cps數目之和具有正相關性，但線性范圍起點的cps數要超過1000，否則樣品在電離和離子傳輸階段的損失不能忽視。平行實驗結果表明，當cps數大于1000時，同一肽段在3次測量中cps的波動一般在0．5～1．5倍之間，將所有肽段cps數求和可降低波動值。以上結果表明，當不同樣品中相同蛋白質的總離子強度之和的變化值超過3倍，并結合檢出肽段數目，可為蛋白質半定量分析比較提供參考，而利用最靈敏肽段可提供更準確的定量分析關系。

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2016第十屆中國科學儀器發展年會(ACCSI 2016)第一輪通知

“2016第十屆中國科學儀器發展年會(Annual Conference of China Scientific Instruments 2016，簡稱ACCSI 2016)”，將于2016年4月22日在北京隆重召開。

第十屆ACCSI2016將繼續秉承“科學儀器行業的達沃斯”論壇的高端定位，以研究和探討科學儀器行業以及相關產業現狀、追蹤發展趨勢、促進行業交流為宗旨。

在“新一代信息技術與制造業深度融合”的大趨勢下，作為“立國之本、科技強國之基”的科學儀器行業有哪些新趨勢、新熱點、新應用，是業界管理者共同關心的問題。在國家十三五的開局之年，會議將邀請業內專家、行業領袖深度解讀過去10年科學儀器行業發展的經驗，與科學儀器制造企業管理者、研發者一起，從運營、技術、和市場角度，共同探討科學儀器行業趨勢，新機遇以及如何抓住機遇。

主辦單位:

中國儀器儀表行業協會;中國儀器儀表學會;中國儀器儀表學會分析儀器分會;儀器信息網(www．instrument．com．cn)

協辦單位:

首都科技條件平臺;我要測網(www．woyaoce．cn)

ACCSI2016參會理由

理由一:十周年盛會，不一樣的精彩分享;理由二:行業十年騰飛路，引領行業發展走向;理由三:掌握行業發展數據借勢發揮企業優勢;理由四:調研數據指導做大科學儀器市場的“蛋糕”;理由五:行業高端人式對話，解析行業脈膊;理由六:助推儀器成果轉化，鼓勵創新創業同行;理由七:借力資本市場助力企業騰飛;理由八:必須知道的互聯網+……;

年會網站:http://accsi．instrument．com．cn

會務組聯系方式

電話:4000074077傳真:010-82051730

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報名參會:010-51654077-8055杜女士

Email:accsi@instrument．com．cn

2016中國科學儀器發展年會組委會

2015年9月

(儀器信息網供稿)

Application of High Resolution Time-of-Flight Mass Spectroscopy in Relative Quantitative Analysis in Proteomics

HONG Xiao-Yu1，WANG Hao1，XU Jin-Ling1，LIShui-Ming2，WANG Yong*2
1(College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Microorganism，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)2(College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

By using the high resolution mass spectrometer TripleTOF 5600，three kinds of standard proteins including bovine serum albumin(BSA)，ovalbumin(OVA)and lysozyme C(LYZC)were analyzed，and the correlationship between the ion intensity ofmass spectrometry and the relative content of protein sample was investigated．The protein samples were digested by trypsion and diluted to 1－1024 fmol in 7μL．The ion counts per second(cps)were used to stand for the amounts of proteins and peptides．Then the correlation between sum of ion intensity(cps)of all the peptides，number of peptides detected and the amountof proteinswas investigated．By comparing the change of values of the same sample in three parallel experiments，a linear relationship between these indexes and the amount of proteinswithin 1－1024 fmolwas found when the cpswas more than 1000．Usually，themaximal ion intensity was nomore than 1．5 times of theminimum value for same peptide in triplicate experiments，which suggested that the 3 times or more change of ion intensity was the minimum threshold to determine the differences of proteins amounts in different samples．This study provides a relative quantitative analysis method using qualitative data of high resolution and high scan speed mass spectrometry，which can quickly and easily provide reference for biological and medical research．

Quantitative proteomics;High resolution time-of-flightmass spectrometry;Counts per second; Signal intensity;Label-free quantification

22 September 2015;accepted 12 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150751

2015-09-22收稿;2015-12-12接受

本文系深圳市科技項目(Nos．JSGG20140703163838793，20150006)資助

*E-mail:wyong@szu．edu．cn