全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜法同時檢測水稻中6種內源性植物激素

夏群辛培勇褚金芳*(中國科學院遺傳與發育生物學研究所國家植物基因研究中心(北京)，北京000)(中國科學院大學，北京00049)

全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜法同時檢測水稻中6種內源性植物激素

夏群1，2辛培勇1褚金芳*1
1(中國科學院遺傳與發育生物學研究所國家植物基因研究中心(北京)，北京100101)2(中國科學院大學，北京100049)

建立了同時檢測水稻中6種內源性植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid，IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)的全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜方法。植物樣品經過甲醇提取，采用C18固相萃取柱富集凈化，流動相將待測物洗脫至C18分析色譜柱進行分離，最終使用串聯四極桿質譜進行檢測。方法的線性范圍為8～320μg/L，相關系數為R2≥0．99;方法的檢出限(S/N=3)范圍為0．1～0．8μg/kg;實際樣品中方法回收率范圍為71．2%～126%，RSD＜13%。應用本方法快速、準確地檢測了水稻幼穗中多種內源性植物激素的含量，并與目前植物學領域內常用的檢測方法進行了比較。同時，本方法對水稻受傷葉片的內源植物激素含量變化進行了定量分析，其含量隨受傷時間的變化趨勢與其生物背景的實驗結果相吻合。

植物激素;在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜;定量分析;水稻

1　引言

植物激素是植物體內產生的一系列天然小分子化合物，參與調控植物的株型建成、光合作用及水分營養利用等重要生理過程［1］。植物激素在植物體內含量極低，通常在鮮重0．1～50μg/kg的范圍內，且植物體內化合物種類復雜多樣，因此，植物激素的定性和定量分析一直是植物激素研究領域的難點之一［2，3］。離線固相萃取(Off-line SPE)［4，5］前處理手段結合液相色譜-串聯質譜聯用是目前常用的分析檢測技術［6～8］，但操作相對繁瑣、費時，且易引入誤差。隨著技術的發展，在線固相萃取(On-line SPE)越來越多地與液相色譜聯用，該技術具有操作簡便、分析速度快、重現性與精密度好等優點，多應用于基質相對簡單的樣品，如水、牛奶等［9，10］，而復雜基質中痕量植物激素的應用報道較少［11，12］。

水稻是重要的糧食作物之一，其產量與品質直接關系到全球的糧食安全問題。植物激素對水稻產量的提高與品質的保持起著至關重要的作用［13］。因此，建立水稻材料中高通量和高靈敏度的多種植物激素同時分析方法，對內源植物激素的網絡互作和水稻育種研究具有重要意義，但目前對水稻內源多種植物激素同時分析的方法研究較少［14］。本實驗基于在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜聯用技術(On-line SPE-LC-MS/MS)開發了一種可以同時檢測水稻中6種植物激素的方法。相對于傳統的植物激素分析方法，本方法具有分析速度快、通量高、重現性與精密度良好等優點。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

SymbiosisTMPharma在線固相萃取-液相色譜系統(荷蘭Spark Holland公司)，配柱溫箱;C2SE、C8EC-SE和C18HD在線固相萃取柱(10 mm×2 mm，7μm，19．4 mg，荷蘭Spark Holland公司);Quattro Premier XE三重四極桿質譜儀(美國Waters公司)。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)標準品(美國Sigma公司);水楊酸(Salicylic acid，SA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid，IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)標準品(德國Dr．Ehrenstorfer公司);ABA穩定同位素內標(2H6-ABA，捷克OlChem Im公司);其它穩定同位素內標(2H5-JA、2H4-SA和2H2-IAA，加拿大CDN Isotopes公司)。甲醇和乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司);乙酸(LC-MS級，美國Fluka公司);甲酸(分析純，美國Acros Organics公司)。實驗所用18．2 MΩ超純水由PURELAB純水儀(英國ELGA公司)制備。

2．2實驗條件

質譜條件:電噴霧離子源負離子模式(ESI-);毛細管電壓為2．80 kV;源溫110℃;脫溶劑氣溫度400℃;脫溶劑氣流速800 L/h;錐孔氣流50 L/h;倍增器電壓650 V;碰撞氣(氬氣)0．17 L/h;掃描方式多重反應監測(MRM)模式;優化的質譜參數見表1。

表1　目標化合物的質譜參數Table 1　MRM parameters for tandem mass spectrometry

色譜條件:Waters公司XBridgeTMBEH C18色譜柱(3．0 mm×75 mm，2．5μm);流動相A為0．2% (V/V)乙酸;流動相 B為甲醇;梯度洗脫程序:0～0．5 min，20%B;0．5～11 min，20%～95%B; 11～11．5 min，95%B;11．5～12 min，95%～20%B;12～14．5 min，20%B;流速0．2 mL/min;柱溫30℃。

在線固相萃取條件:SPE柱經過1 mL甲醇和1 mL 1%(V/V)甲酸活化平衡，流速5mL/min;10μL樣品由0．4 mL 1%(V/V)甲酸上樣，流速0．7mL/min;淋洗液為0．9mL 1%(V/V)甲酸和0．1mL 1%(V/ V)甲酸-甲醇的混合液，流速5 mL/min;淋洗后，流動相將待測物梯度洗脫至分析柱，洗脫時間7 min，流速0．2 mL/min;洗脫的同時，新的SPE柱進行活化、上樣和淋洗。

2．3方法學考察實驗

ABA，IAA，SA，JA，IPA和IBA標準品儲備液為5 mg/L，溶劑為甲醇，于-20℃儲存。用80% (V/V)甲醇稀釋儲備液，配制工作溶液為20μg/L混合標準品，儲存于4℃。通過稀釋標準品儲備液，配制5個濃度的混合標準品進樣分析，計算標準曲線。ABA，IAA，SA和JA采用穩定同位素稀釋法進行定量分析，IPA與IBA采用外標法進行定量分析。取低中高3個濃度的標準品溶液連續進樣5天，每天測定5次，考察方法的精密度。在水稻幼穗中加ABA，IAA，SA和JA的同位素內標以及IPA、IBA標準品，按S/N=3和S/N=10確定方法的檢出限和定量限。在水稻基質中，采用標準添加法，計算低中高3個濃度的方法回收率。

2．4樣品前處理和水稻培養與傷害

水稻植物材料在液氮條件下收集與研磨。稱取約0．2 g鮮重植物材料于7 mL離心管中，加入2 mL甲醇(含銅試劑)，同時加入2H6-ABA，2H2-IAA，2H4-SA和2H5-JA各10 ng，渦旋混合，-20℃過夜提取。于4℃下，以15000 r/min離心15 min，收集上清液，氮氣吹干溶解于200μL 80%(V/V)甲醇中，經0．2μm PTFE濾膜過濾后，由在線固相萃取系統分析。

水稻種子由70%乙醇和2．5%次氯酸鈉消毒后于37℃萌發，將萌發的種子轉移至玻璃培養管中，用Hoagland全營養液進行培養，培養條件為:光/暗周期(16/8 h);溫度25℃;濕度70%。傷害實驗材料為3周水稻幼苗，對水稻幼苗第三片完全展開的葉片用止血鉗夾出2個傷口，間隔4 cm，收集受害5，15，30，60，120和360 min后的葉片，考察多種植物激素含量變化。

3　結果與討論

3．1液相色譜條件優化

分別比較了乙腈和甲醇作為色譜有機流動相時，6種目標化合物保留行為。當乙腈作為有機相時，隨著混合標準品進樣次數的增加，ABA，JA與IBA的質譜響應穩定，而IAA，SA與IPA的響應逐漸降低;當甲醇作為有機相時，6種植物激素都能保持穩定的質譜響應，并且分離度較好。本實驗選擇了甲醇作為有機流動相。在流動相中添加少量的添加劑可以增強質譜離子源的離子化效率，實驗分別考察了10 mmol/L甲酸銨、0．05%甲酸、0．05%乙酸、0．1%乙酸和0．2%乙酸作為添加劑時的效果。添加乙酸時，IPA，IBA，SA與JA的質譜平均響應峰面積比添加甲酸時高(圖1)，因此選擇用乙酸調節pH值。盡管添加0．05%乙酸時其它5種植物激素的平均響應峰面積最高，但是IAA響應峰面積的RSD＞15%，因此最終選擇了0．2%(V/V)乙酸作為水相流動相。

圖1　不同添加劑(甲酸銨、甲酸和乙酸)對6種植物激素質譜響應峰面積的影響Fig．1　Effects of different addictives(ammonium formate，formic acid and acetic acid)in aqueous mobile phase for the response of six phytohormones

3．2在線固相萃取方法優化

3．2．1在線固相萃取柱的選擇考察了目標化合物在3種反相填料SPE柱(C2SE，C8EC-SE和C18HD)上的保留情況。C8EC-SE和C18HD對6種酸性植物激素保留能力較強，C2SE保留能力最弱。C18HD作為在線固相萃取柱時，IAA和SA的質譜響應峰面積比C8EC-SE更高(圖2)，說明C18HD對標準品的回收率更高，最終選用C18HD柱作為在線固相萃取柱。

圖2　不同SPE柱對分析物保留能力的比較Fig．2　Comparison of different SPE sorbents for six phytohormones

3．2．2淋洗條件的優化淋洗液為1%(V/V)甲酸(A)和1%(V/V)甲酸-甲醇(B)混合溶液，分別比較了1 mL不同比例(B/(A+B)，0，10%，15%和20%)淋洗液的淋洗效果。當B所占比例為15%時，IAA和SA的響應峰面積下降明顯;當B所占比例為10%和0時，質譜響應峰面積差別較小(圖3)，說明目標化合物的損失較小，最終淋洗液中B的比例選擇10%。

圖3　不同淋洗有機相比例的比較Fig．3　Comparison of different percentage of organic solution for six phytohormones

3．2．3洗脫時間的優化C18HD SPE柱和分析色譜柱都基于反相作用機理保留和分離化合物。IAA最先被洗脫，JA最后被洗脫。梯度洗脫時間太短(小于6 min)，洗脫回收率較低;洗脫時間太長，在分析植物樣品時會轉移更多的雜質至分析色譜柱。最終洗脫時間選擇7 min(圖4)。

圖4　洗脫時間的優化Fig．4　Optimization of elution time for six phytohormones

3．3方法學考察

方法的線性回歸方程的相關系數R2＞0．99。方法的檢出限范圍為0．1～0．8μg/kg(表2)，定量限范圍為0．4～2．5μg/kg(表2)。6種植物激素的回收率的為71．2%～126．0%，RSD為2．4%～12．8%(表3)。

表2　線性方程、線性范圍和方法回收率(n=6)Table 2　Linear relationships and spiked recoveries(n=6)

表3　方法的日內精密度(RSD，%，n=5)、日間精密度(RSD，%，n=5)、檢出限和定量限Table 3　Intraday precision(n=5)，interday precisions(n=5)，LODs and LOQs

3．4方法的驗證與應用

目前植物學領域普遍使用的植物激素定量分析數據是由樣品經離線SPE前處理后，液相色譜-質譜聯用分析得到的［8，15］。分別用離線SPE分析方法［8］和本研究建立的在線SPE方法分析水稻幼穗中內源性植物激素的含量，結果見表4。兩種方法定量分析結果相近，該結果驗證了本方法的準確性。在線SPE-LC-MS/MS方法可檢測到的目標化合物的色譜圖如圖5所示，IPA和IBA由于含量低，在樣品中未檢出。

表4　在線固相萃取方法和離線方法分析水稻幼穗6種內源性植物激素(n=3)Table 4　Quantitative results of six phytohormones concentrations in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MSand off-line SPE-LC-MS/MS(n=3)

圖5　在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜分析水稻幼穗中植物激素色譜圖Fig．5　Chromatograms of phytohormones in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MS

為進一步驗證方法的可靠性，考察了水稻幼苗葉片受傷后內源性植物激素含量的變化，結果見圖6。IAA的含量變化較小，在(3．9±0．9)μg/kg和(8．3±0．8)μg/kg之間(圖6A)，沒有明顯的證據表明IAA參與植物的傷害反應。ABA是植物應對干旱、鹽脅迫等環境壓力的激素［16］。從圖6B可見，內源的ABA含量在30 min后明顯上升，很可能是因為植物葉片失水后，ABA作為信號分子會使保衛細胞的氣孔縮小，減少植物葉片的失水。在圖6C中，SA的含量變化較小，在(337．5±81．6)μg/kg和(528．5± 69．0)μg/kg之間，對外界傷害的反應不明顯，符合SA調控抗性的機理研究，即SA介導的抗性主要是針對細菌、病毒、真菌和卵菌等一系列病原菌的入侵［17］。生物學研究表明，JA是植物應對傷害反應重要的信號分子，植物受傷后JA的含量會顯著上升［8］。當葉片沒有受到傷害時，JA的含量在定量限以下，含量低于0．4μg/kg;在受傷后60 min時，受傷葉片的JA含量達到最高，為(91．9±2．3)μg/kg;之后JA的含量開始下降，360 min時為(30．4±5．9)μg/kg。JA的濃度先升高后降低，再升高最后又降低的趨勢，在圖6D中表現為雙峰現象，這一變化趨勢與文獻［5］完全符合。

4　結論

建立了在線固相萃取-液相色譜-串聯質譜聯用技術定量檢測水稻中6種內源性植物激素的方法。在線固相萃取方法簡化了植物激素分析的樣品前處理流程，使得分析速度與操作的簡便性大大提高。本方法與植物研究領域內公認方法所得到的定量分析結果基本一致，并通過分析受傷葉片植物激素含量的變化，進一步驗證了方法的準確性和可靠性。本方法能同時分析多種內源性植物激素，將非常有助于水稻以及其它植物材料中內源性植物激素的互作研究。

圖6　水稻幼苗葉片受傷后內源植物激素IAA(A)、ABA(B)、SA(C)和JA(D)濃度變化(n=3)Fig．6　Concentration change of IAA，ABA，SA and JA in wounded leaves of rice seedlings(n=3)

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Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．91417314)，and the Technique Innovation of Instrumental Function of CASProgram and CASKey Technology Talent Program

An Automated On-line Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric Method for Six Endogenous Phytohormones Analysis in Rice

XIA Qun1，2，XIN Pei-Yong1，CHU Jin-Fang*1
1(National Centre for Plant Gene Research(Beijing)，Institute of Genetics and Developmental Biology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)2(University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)

An automated on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry (on-line SPE-LC-MS/MS)method for the simultaneous quantification of six endogenous phytohormones including abscisic acid(ABA)，indole-3-acetic acid(IAA)，salicylic acid(SA)，jasmonic acid(JA)，indole-3-propionic acid(IPA)and indole-3-butyric acid(IBA)in rice tissues was described．Plant samples were extracted withmethanol and on-line SPE procedurewas performed with C18SPE cartridges．Analyteswere eluted to C18analytical column withmobile phase and further analyzed by LC-MS/MS．The performance of the method was fully validated．Linearity showed good correlation(R2≥0．99)．Limits of detections(S/N=3) were in the range of 0．1－0．8μg/kg．Recoveries varied between 71．2%and 126%．Themethod was rapid and sensitive to determinemultiple phytohormones in rice young panicles and the resultswere cross-validated with the off-line SPE-LC-MS/MS phytohormone analyticalmethod．Finally，themethod was applied tomonitor the changes of ABA，IAA，SA and JA in wounded rice leaves．The trendswere in accord with plant physiological processes．

Phytohormones;On-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Quantitative analysis;Rice

29 September 2015;accepted 30 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150769

2015-09-29收稿;2015-12-30接受

本文系國家自然科學基金(No．91417314)、中科院儀器設備功能開發技術創新項目和中科院關鍵技術人才項目資助

*E-mail:jfchu@genetics．ac．cn