MicroRNA-7在CD4+T細胞體外活化中的表達及意義①

徐華林　趙娟娟　崔盼盼　郭萌萌　陶弋婧　陳　超　徐　林

( 遵義醫學院免疫學教研室暨貴州省生物治療人才基地，遵義563099)

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MicroRNA-7在CD4+T細胞體外活化中的表達及意義①

徐華林趙娟娟崔盼盼郭萌萌陶弋婧陳超徐林

( 遵義醫學院免疫學教研室暨貴州省生物治療人才基地，遵義563099)

目的：觀察microRNA-7(miR-7)在體外活化CD4+T細胞中表達的變化，初步探討其意義。方法：采用免疫磁珠分選法(MACS)獲得FVB小鼠脾臟中CD4+CD62L+T細胞，經抗CD3/CD28抗體刺激后，Real-time PCR檢測miR-7表達水平，FACS檢測活化膜分子CD69的表達變化；進一步觀察刺激不同時間點CD4+T細胞中miR-7表達的變化；觀察ERK抑制劑 PD98059 處理后，CD4+T細胞活化下miR-7表達的變化，同時CCK8法檢測細胞增殖變化，FACS檢測CD69和CD62L分子的表達變化；最后， Real-time PCR檢測各組細胞中IL-6、IL-10和IFN-γ等細胞因子表達水平變化。結果：與對照組相比，抗CD3/CD28抗體刺激后，CD4+CD62L+T細胞中miR-7表達水平顯著上調,CD69分子的表達明顯增加(P<0.05)；與刺激0 h組和24 h組相比，48 h組和72 h組miR-7的表達水平顯著上調(P<0.05)；PD98059處理組中，CD4+T細胞的miR-7表達水平顯著下降(P<0.05)，同時，活化膜分子CD69的表達比例明顯降低(P<0.05)；最后，細胞表達IL-6、IL-10和IFN-γ的水平均顯著減弱(P<0.05)。結論：miR-7在活化的CD4+T細胞中明顯上調，并與ERK信號相關，為后續探討miR-7在CD4+T細胞功能中的作用提供了前期實驗基礎。

miR-7；CD4+T細胞；ERK信號途徑；細胞因子

微小RNA (microRNA，miRNA)是一類主要在轉錄后水平降解靶mRNA 或抑制蛋白質翻譯來調控目的基因表達的非編碼小分子RNA[1]。大量研究顯示，miRNAs參與了機體組織細胞的發育、分化及腫瘤的發生、發展等多種重要的生物學過程[2,3]。miR-7作為miRNA分子家族成員之一，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的發生發展中有重要作用[4-6]。我們前期研究中也發現其可有效調控人肺癌細胞的體內、外生長和侵襲[7,8]。有意思的是，我們新近利用海綿體(Sponge)技術構建了miR-7基因敲減(Knock down，KD)小鼠模型[9,10]，且發現在miR-7KD小鼠的腸系膜淋巴結αβCD4+T細胞的比例和細胞絕對數發生了顯著變化，且其活化相關膜分子CD62L和CD69的表達也發生明顯改變[11]，提示miR-7可能參與了CD4+T細胞活化等生物學功能的調控。然而， miR-7在CD4+T細胞的活化及相關功能中的潛在作用及分子機制至今仍未有研究報道。因此，本研究中我們擬初步觀察CD4+T細胞體外活化前后miR-7表達的變化，并初步探討其表達變化的可能機制，以期為后續深入探討miR-7在CD4+T細胞活化及功能中的作用提供前期實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料FVB 背景的SPF 級雌性野生型小鼠；鼠源CD4+CD62L+T細胞磁珠分選試劑盒(德國Miltenyibiotec公司)；ERK信號抑制劑PD98059(TOCRIS公司)；TRIZOL試劑、CDNA單鏈合成試劑盒以及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)均購自TaKaRa；R-Phycoerythrin(PE) 標記的CD62L抗鼠的單克隆抗體，Percp-Cy5.5 標記的CD4抗鼠單克隆抗體，Allophycocyain(APC)標記的CD69 抗鼠單克隆抗體， Fixation/Perme-abilization Diluent (Ebioscie-nce)；CCK-8試劑(博士德公司)；顯微鏡(Olymp-us)；流式細胞儀(Beckman Coulter)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；二氧化碳培養箱(THERMO公司)；TD5AWS臺式低速離心機(湘儀儀器)；C1000TMThermalcycler 熒光定量PCR儀。

1.2方法

1.2.1免疫磁珠分選CD4+CD62L+T細胞收集與培養將8 周齡WT 小鼠斷頸處死，酒精浸泡5 min，常規提取脾臟細胞后做成單細胞懸液，預留一部分脾細胞，剩余細胞按德國Miltenyibiotec公司磁珠分選試劑盒說明書先陰性分選獲得CD4+T細胞，后經陽性分選獲得CD4+CD62L+T細胞和 CD4+CD62L-T細胞，計數，并預留一部分CD4+CD62L+T細胞，剩余CD4+CD62L+T細胞并按1.6×105孔密度鋪于預先用CD3抗體包被的96孔板，同時加入4 μg/ml的CD28和20 ng/ml的IL-2。48 h后，實驗組加入ERK信號抑制劑(PD98059)，使終濃度為990 nmol/L，而對照組則加入相同劑量的無菌PBS。小鼠的CD4+CD62L+T細胞分為對照組和PD98059組。

1.2.2CCK-8法檢測CD4+CD62L+T細胞增殖情況Cont組和PD98059組在分別加入PBS和抑制劑培育24 h時，分別加入20 μl CCK8，輕柔混勻避免產生氣泡，繼續培養2 h后，利用酶標儀檢測各孔的吸光度(OD)值(波長450 nm)。

1.2.3流式細胞術檢測CD4+T細胞膜表面分子CD62L、CD69表達變化 獲得的未活化的CD4+CD62L+T細胞(對照組)和活化48 h后CD4+CD62L+T細胞(aCD3/CD28組)并制成單細胞懸液，PBS洗滌1遍，1 200 r/min離心5 min，吸掉上清，加入200 μl PBS重懸細胞，加入抗鼠熒光標記抗體APC-CD69各1 μl，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，加入PBS重懸細胞后用Beckman流式細胞儀檢測。后收集已加入無菌PBS共陪育24 h的對照組和加入ERK抑制劑共培育24 h的PD98059組細胞并分別制成單細胞懸液，PBS洗滌1遍，1 200 r/min離心5 min，棄去上清，加入200 μl PBS重懸細胞，加入抗鼠熒光標記抗體Percp-Cy5.5-CD4、PE-CD62L、APC-CD69各1 μl，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，加入PBS重懸細胞后用Beckman流式細胞儀檢測。

1.2.4miR-7表達水平的檢測將1.2.1的預留的CD4+T細胞、CD4+CD62L-T細胞、CD4+CD62L+T細胞(0 h的CD4+CD62L+T細胞)、經抗CD3/CD28抗體活化24 h的CD4+CD62L+T細胞、經抗CD3/CD28抗體活化48 h的CD4+CD62L+T細胞、加入PD98059抑制劑后共孵育24 h的PD98059組細胞、加入無菌PBS后共孵育24 h的對照組分別經TRIZOL法提取RNA，使用U6和miR-7反轉錄引物，對提取的RNA進行轉錄，最后經基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR莖環法檢測各組miR-7和U6的表達水平[12]。

1.2.5CD4+T細胞相關細胞因子表達水平的檢測利用Real-time PCR，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(×2)檢測以下基因。見表1。

2　結果

2.1CD4+T細胞活化前后miR-7表達水平變化MACS常規分選小鼠CD4+CD62L+T細胞和CD4+CD62L-T細胞。我們首先檢測了CD4+CD62L+T細胞中miR-7的表達情況。結果顯示，與CD4+CD62L-T細胞相比，CD4+CD62L+T細胞低表達miR-7(圖1A，P<0.05)。重要的是，我們發現經抗CD3/CD28抗體刺激48 h后，CD4+CD62L+T細胞中miR-7表達水平明顯增加，同時細胞膜分子CD69的表達水平顯著增加(圖1B、C，P<0.05)。

2.2在CD4+T細胞活化的不同時間點 miR-7表達情況顯微鏡下觀察顯示，活化后的CD4+T細胞克隆數量明顯增多(圖2A)。Real-time PCR 結果檢測顯示CD4+T細胞中miR-7的表達水平在活化后12 h降低，然后逐漸增加，并到72 h達到高峰，呈現先下降后升高的趨勢(圖2B，P<0.05)。

2.3ERK抑制劑對CD4+CD62L+T細胞活化中miR-7表達的影響為了進一步探討CD4+T細胞活化過程中miR-7表達上調的可能信號途徑機制，我們觀察了ERK抑制劑PD98059處理對miR-7表達的可能影響。結果顯示，與對照組相比，PD98059處理組中細胞增殖明顯減弱(圖3A、B，P<0.05)，更重要的是，在抗CD3/CD28抗體刺激48 h后加入抑制劑PD98059共孵育24 h，miR-7表達水平顯著下調(圖3C，P<0.05)。

2.4CD4+T細胞相關膜分子CD62L、CD69分子表達變化我們進一步用FACS檢測CD4+T細胞CD62L、CD69分子表達水平。如圖4所示，與對照組相比，PD98059處理組細胞膜CD62L的表達水平較對照組顯著增加(圖4A，P<0.01)，而CD69分子的表達水平， PD98059組顯著降低(圖4B ，P<0.05)。

表1基因名稱及引物序列

Tab.1Gene names and prime sequences

MousegeneForwardprimerReverseprimerGAPDH5'-GAGCCAAACGGGTCATCATCT-3'5'-GAGGGGCCATCCACAGTCTT-3'IL-45'-AAGAGGACACTGGAGCAA-3'5'-AGACATCCCGAAGGTTCC-3'IL-65'-CCCAATTTCCAATGCTCTCCTA-3'5'-AGGAATGTCCACAAACTGATATGCT-3'IFN-γ5'-CACTCGACCTTAATCTA-3'5'-CTCTTGATTCAATGCTTCA-3'

圖1　CD4+CD62L+T細胞經抗CD3/CD28抗體刺激后miR-7和CD69的表達變化Fig.1　Change on expression of miR-7 and CD69 in CD4+CD62L+T cells after anti-CD3/CD28 antibody stimulationNote: A,B.Real-time PCR assay;C.FACS assay.*.P<0.05,**.P<0.01，compared with control group.

圖2　CD4+T細胞活化的不同時間點 miR-7表達情況Fig.2　Expression of miR-7 in activated CD4+T cells at different time pointsNote: A.Microscope(Arrow indicates cell clone)； B.Real-time PCR assay；*.P<0.05,compared with control group.

圖3　抑制劑PD98059作用后CD4+T細胞增殖和miR-7表達改變Fig.3　Effect of inhibitor PD98059 on proliferation of CD4+T cells and change of expression of miR-7Note: A.Microscope;B.CCK-8 assay;C.Real-time PCR assay.*.P<0.05，compared with control group.

圖4　抑制劑 PD98059作用后CD4+T細胞膜 CD62L和CD69分子的表達變化Fig.4　Effect of inhibitor PD98059 on expression of CD62L and CD69 in CD4+ T cellsNote: *.P<0.05,compared with control group.

圖5　抑制劑 PD98059作用后CD4+T細胞相關細胞因子的表達變化Fig.5　Effect of inhibitor PD98059 on expression of cytokines in CD4+T cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

2.5CD4+T細胞相關細胞因子的表達變化Real-time PCR結果顯示，與對照組相比，PD98059處理組CD4+T細胞的IL-4，IL-6和IFN-γ表達水平均顯著降低(如圖5A，P<0.05)。

3　討論

近年來，大量文獻報道miRNAs與T細胞增殖、活化以及凋亡密切相關[13,14]。如miR-17-92在CD4+T細胞和CD8+T細胞上高表達，可促進T淋巴細胞的增殖，導致血清抗體增加，致使自身免疫性疾病的發生[15]；類似的，miR-146a缺陷型的T細胞對T細胞受體(T cell receptor，TCR)信號有高度反應性，促進炎癥的發生[16]。對于miR-7而言，我們前期發現miR-7敲減后腸系膜淋巴結中αβCD4+T細胞的CD62L的表達水平顯著下調，而CD69的表達水平卻明顯上調，提示miR-7可能作為一個負性調控分子，參與CD4+T的活化等生物學功能調控[11]；而在本研究中，我們發現CD4+CD62L+T細胞較CD4+CD62L-T細胞低表達miR-7，進一步發現CD4+T活化后，miR-7表達水平明顯增加，提示miR-7與CD4+T細胞的活化密切相關。有意義的是，進一步發現在活化不同時間點上，miR-7在CD4+T細胞中表達水平呈現先下降后升高的趨勢，該趨勢與我們前期發現miR-7可能是CD4+T細胞重要的負調控分子是一致的。上述研究表明，特定miRNAs分子在CD4+T細胞的發育和功能中發揮了重要的調控作用。然而，miR-7對CD4+T細胞功能的確切調控效應及機制有待后續研究闡明。

胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)信號轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有重要作用[17]。新近研究報道，ERK信號通路與miRNAs分子表達密切相關，如Wu等[18]發現在C2C12成肌細胞中，肌生成抑制素 (Myostatin，MSTN)可通過ERK信號通路調節miR-431的表達水平；Wang等[19]也報道在活化的CD4+T細胞中，抑制ERK信號后，miR-21表達水平明顯降低，同時，miR-21作為T細胞活化的一個反饋環節的重要調控因子，又可明顯促進ERK磷酸化信號的上調。類似地，在本研究中，我們發現ERK信號通路的抑制劑PD98059可顯著抑制CD4+T細胞中miR-7的表達。與此同時，CD4+T細胞的增殖能力及活化相關分子CD69和CD62L的表達明顯改變。此外，我們還發現CD4+T細胞中細胞因子IL-4、IL-6和IFN-γ的表達均明顯下降。這些結果提示T細胞受體信號活化后，miR-7水平的改變可能與ERK信號通路密切相關。然而CD4+T細胞的增殖、活化等生物學功能的改變是否是由于miR-7水平改變所致，以及ERK信號通路改變miR-7表達水平的具體用機制仍不清楚。此外，CD4+T細胞活化過程中miR-7表達與其他信號途徑，如：信號轉導子和轉錄激活子(Signal transducer and activator of transcr-iption，Stat)、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 kinase /protein kinase B，PI3K/AKT)等是否存在關聯等問題仍需進一步深入研究。

總之，本研究中我們首次發現miR-7的表達水平在CD4+T細胞活化前后明顯改變，且該變化與ERK信號途徑密切相關，這為后續深入研究miR-7分子在CD4+T細胞活化及功能中的作用提供了重要前期實驗基礎。

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[收稿2016-01-04修回2016-02-23]

(編輯許四平)

Significance and expression of miR-7 in activated CD4+T cells

XU Hua-Lin,ZHAO Juan-Juan,CUI Pan-Pan,GUO Meng-Meng,TAO Yi-Jing,CHEN Chao,XU Lin.

Department of Immunology,Zunyi Medical University,Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province,Zunyi 563099,China

Objective:To investigate the change of expression of miR-7 in activated CD4+T cells in vitro,and preliminary explore its possible significance.Methods: CD4+CD62L+T cells was purified from splenocytes of FVB mice by magnetic cell sorting system (MACS).After stimulation with anti-CD3/CD28 antibody,the relative expression of miR-7 was examined by Real-time PCR,and the expression level of CD69 molecular was analyzed by FACS.Furthermore,the relative expression of miR-7 in CD4+T cells was detected at different time points during stimulation.With the treatment of ERK inhibitor PD98059,change of miR-7 expression was determined by Real-time PCR.Meanwhile,the proliferation of CD4+T cells was examined by CCK-8 assay and the expression level of CD69 and CD62L molecular were analyzed by FACS.Finally,the expression of cytokines IL-6,IL-10,and IFN-γ were determined by Real-time PCR.Results: Compared with control group,the relative expression of miR-7 was increased significantly after stimulation with anti-CD3/CD28 antibody,as well as expression level of CD69 molecular was augmented(P<0.05).In contrasted with 0 h and 24 h,the expression of miR-7 was significantly increased after 48 h and 72 h during stimulation(P<0.05).Furthermore,the relative expression of miR-7 was significantly declined in CD4+T cells in ERK inhibitor PD98059 treatment group.Finally,the expression level of CD69 molecular,as well as cytokines IL-6,IL-10 and IFN-γ,were also decreased significantly(P<0.05).Conclusion: The relative expression of miR-7 was significantly increased in activated CD4+T cells,closely related to ERK pathway,which provided an important foundation for successive research work on exploring the functional role of miR-7 in the CD4+T cells.

miR-7;CD4+T cells;ERK pathway;Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.003

①本文受國家自然科學基金(No.31370918)、貴州省高層次創新人才計劃[黔科合人才(2016)4031號]和遵義醫學院優秀青年人才計劃項目(15ZY-001)資助。

徐華林(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事分子免疫學的研究。

及指導教師：徐林(1977年-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤免疫學和分子免疫學研究，E-mail：xulinzhouya@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)10-1419-05