力達霉素誘導人宮頸癌Caski細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡①

王發(fā)玲　秦　燁　曹春雨　李　倩　王艷林　楊建林

(三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室,宜昌443002)

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力達霉素誘導人宮頸癌Caski細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡①

王發(fā)玲秦燁曹春雨李倩王艷林楊建林

(三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室,宜昌443002)

目的：探討抗腫瘤藥物力達霉素能否抑制人宮頸癌Caski細胞增殖并且誘導Caski細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡。方法：MTT比色法檢測Caski細胞增殖；Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測Caski細胞凋亡。Western blot 分析細胞中Bax和Bcl-2的表達；免疫熒光流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡后細胞膜上鈣網(wǎng)蛋白的表達。結(jié)果：力達霉素抑制Caski細胞的增殖，具有時間和劑量依賴性；5 μg/L的力達霉素作用Caski細胞48 h后，腫瘤細胞凋亡率為11.5%；Bax表達量顯著增加，而Bcl-2含量明顯減少(P<0.05)；細胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白表達高達67.2%,顯著高于對照組的2.31%。結(jié)論：力達霉素能夠有效抑制人宮頸癌Caski細胞增殖，其作用機制與線粒體途徑誘導細胞凋亡相關，同時促使鈣網(wǎng)蛋白轉(zhuǎn)移到Caski細胞膜表面表達，可能具有誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡的能力。

力達霉素；Caski細胞；免疫原性細胞凋亡

腫瘤的免疫逃逸機制是惡性腫瘤患者長期復發(fā)的重要機制之一。近年來研究表明，紫外線、γ-射線和蒽環(huán)類化療藥物能促使腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡，進而介導機體特異性抗腫瘤免疫應答[1-3]的發(fā)生。而在此過程中，鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)從凋亡細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至細胞膜表面大量表達是凋亡細胞具有免疫原性的關鍵因素[4,5]。尋求更多能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡的藥物，對提高抗腫瘤臨床治療的療效和預后將起到一定的積極作用。

力達霉素(Lidamycin,LDM,C1027)是一種新的烯二炔類抗腫瘤抗生素，它是從潛江縣的土壤里面分離出的一株鏈霉菌Streptomyces globis-porus的代謝產(chǎn)物中分離得到的，通過非共價鍵將一個酸性蛋白(含110個氨基酸)和一個烯二炔結(jié)構(gòu)結(jié)合而組成。研究表明，力達霉素對多種腫瘤細胞均具有很強的殺傷作用。力達霉素能夠誘導人結(jié)腸癌細胞發(fā)生衰老，有效地抑制卵巢癌細胞、人急性髓性白血病細胞的增殖，較強抑制肝轉(zhuǎn)移灶增生并促進腫瘤細胞凋亡，顯著地抵抗小鼠骨髓瘤細胞在體內(nèi)和體外的生長作用等[6-8]。但是力達霉素能否誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡目前尚未有研究報道。本文以人宮頸癌Caski細胞株為研究對象，研究力達霉素對人宮頸癌Caski細胞增殖的影響以及作用機制，并進一步探討力達霉素是否能夠介導凋亡的Caski細胞發(fā)生CRT的膜轉(zhuǎn)位，從而誘導Caski細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡，為力達霉素在宮頸癌的臨床應用上提供新的思路和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人宮頸癌Caski細胞[中國細胞典藏中心(武漢)本實驗室培養(yǎng)保存]；力達霉素(北京協(xié)和醫(yī)科大學甄永蘇教授惠贈)；MTT、β-actin、Bax和Bcl-2多克隆抗體(SANTA CRUZ公司)；CRT抗體(Stressgon公司)；Annexin V/PI雙染試劑盒(Invitrogen公司)；RPMI1640細胞培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶和DMSO等(Gibco公司)；Rnase和蛋白質(zhì)Marker(Fermentas公司)；PVDF膜(Millipore公司)；BCA試劑盒和ECL顯色液(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測力達霉素對Caski細胞增殖的抑制作用用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)人宮頸癌Caski細胞，收集對數(shù)期的Caski細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞濃度至 2×104個/L，取100 μl/孔接種到 96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后分別向細胞孔內(nèi)加入含有力達霉素的1640培養(yǎng)基，使其力達霉素的終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5和10 μg/L，每個濃度孔設置6個復孔，另外設不加藥對照組(正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞組)和空白組(無細胞培養(yǎng)的空白孔組，用以去除本底吸光度干擾)。置于細胞培養(yǎng)箱分別在繼續(xù)培養(yǎng) 24、48和72 h后，去除 96 孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入終濃度為0.2 g/L的MTT試劑100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)上清，加入200 μl DMSO充分溶解，全波長酶標儀570nm波長處檢測吸光度值。藥物對細胞生存的抑制率=1-[(實驗孔A值-空白對照孔A值)/(不加藥對照孔值-空白對照孔值)]×100%。

1.2.2AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測力達霉素誘導Caski細胞凋亡選擇對數(shù)期 Caski 細胞，分別加入含有力達霉素終濃度為10、5 和2.5 μg/L的1640培養(yǎng)液,置于37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。常規(guī)胰酶消化后1 000 r/min 離心 5 min收集細胞，按照說明書步驟操作制備細胞蛋白樣本，流式細胞分析儀檢測細胞PI 及標記在Annexin V上的FITC染色狀況，從而判定力達霉素誘導細胞的凋亡率。

1.2.4免疫熒光流式細胞術(shù)檢測經(jīng)力達霉素處理Caski細胞后，細胞膜表面CRT表達分別收集經(jīng)2.5 和 5 μg/L力達霉素處理48 h的Caski細胞，以1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的Caski細胞為對照，PBS 洗滌細胞1次，1 500 r/min離心 5 min 收集細胞。 在細胞沉淀中加入兔抗人CRT多克隆抗體(用含1%牛血清白蛋白的PBS 1∶200稀釋)，室溫下充分作用1 h，PBS再次洗滌后，加入PE標記的山羊抗兔IgG抗體(用含1%牛血清白蛋白的PBS 1∶200稀釋)室溫避光放置反應30 min ，隨后在避光條件下，PBS再次洗滌，重懸后流式細胞儀檢測分析。

2　結(jié)果

2.1力達霉素對Caski細胞生長有顯著抑制作用低劑量力達霉素即可對Caski細胞增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用。0.625 μg/L的藥物作用細胞72 h即可造成近24.96%的抑制率，5 μg/L的力達霉素對Caski細胞的抑制率高達43.85%，且這種抑制作用隨著藥物濃度增大或藥物處理時間的延長而增強(表1)。

LDM(μg/ml)24h48h72h00±2.090±4.20±4.770.62512.55±1.801)12.27±3.161)24.96±1.832)1.2511.25±1.481)13.00±1.411)28.09±2.672)2.518.58±1.782)18.43±1.372)34.78±3.012)522.74±1.412)31.28±1.162)43.85±1.372)1034.24±1.422)53.08±1.632)57.84±0.652)

Note： 1)P<0.05，2)P<0.01,comparing with control group.

圖1　力達霉素誘導人宮頸癌Caski細胞凋亡Fig.1　Effect of LDM on apoptosis in Caski cell

圖2　力達霉素作用人宮頸癌Caski細胞后Bax和Bcl-2表達水平Fig.2　Effect of LDM on expression of Bax and Bcl-2 in Caski cells Note: *.P<0.01，comparing with control group.

2.2力達霉素誘導Caski細胞凋亡2.5和5 μg/L的力達霉素處理細胞48 h后，F(xiàn)ITC單染的細胞率分別增加至9.2%和11.5%，顯著高于對照組的3.1%，而PI/Annexin V雙染細胞數(shù)量無明顯改變。即低劑量力達霉素(2.5和5 μg/L)處理Caski細胞48 h，便可誘導細胞發(fā)生凋亡，且多處于凋亡早期(圖1)。

圖3　力達霉素作用人宮頸癌Caski細胞后，細胞膜表面CRT表達量增加Fig.3　Effect of LDM on cell surface of CRT protein expression in Caski cell

2.3力達霉素對Caski細胞凋亡蛋白表達的影響分別用2.5 和5 μg/L力達霉素處理Caski細胞48 h后，與對照組細胞相比，Bax表達含量增加，而Bcl-2含量顯著減少(P<0.01)(圖2)。

2.4力達霉素促使Caski細胞膜CRT表達增加2.5 和5 μg/L的力達霉素處理Caski細胞48 h后，細胞膜表面的CRT表達量從對照組的2.31%增加到54.0%和67.2%(P<0.01)(圖3)。

3　討論

力達霉素是一種新的烯二炔類抗腫瘤抗生素，具有高效的抗腫瘤效應，按照半數(shù)抑制濃度IC50比較，它的細胞毒性比絲裂霉素、阿霉素高10 000倍[9]。其抗腫瘤分子機制主要包括損傷遺傳物質(zhì)DNA或RNA、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡及細胞裂亡等相關[9]。但目前為止尚未有力達霉素對人宮頸癌Caski細胞的作用機制以及能否誘導發(fā)生免疫原性細胞凋亡的報道。

本研究結(jié)果顯示，力達霉素對Caski細胞具有高效的抑制作用，藥物劑量僅為5 μg/L處理細胞72 h，細胞抑制率高達43%，其抑制效應與藥物濃度和作用時間成正相關性。AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，5 μg/L力達霉素處理Caski細胞48 h后AnnexinV與轉(zhuǎn)移到細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合，使得標記在AnnexinV上的FITC大量結(jié)合在細胞膜表面，但PI不能穿過完整的細胞膜與細胞染色體結(jié)合，因此FITC熒光強度從3.1%增加到11.5%而PI的熒光強度無顯著改變，符合細胞凋亡早期磷脂酰絲氨酸從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，但仍維持細胞膜完整性的標志性改變，證實力達霉素能有效誘導Caski細胞發(fā)生凋亡，且5 μg/L力達霉素處理Caski細胞48 h，凋亡細胞多處于早期凋亡。Western blot結(jié)果表明，力達霉素作用Caski細胞后，能上調(diào)促凋亡的Bax基因表達同時下調(diào)抑制凋亡的Bcl-2基因。Bax和Bcl-2的比例是影響細胞凋亡的關鍵，Bax高表達,則形成Bax-Bax同源二聚體,定位于線粒體膜,形成跨膜離子通道，導致線粒體跨膜電位的下降、崩潰,從而出現(xiàn)不可逆的細胞凋亡。因此推斷，力達霉素誘導Caski細胞發(fā)生凋亡機制與線粒體途徑相關。

腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞凋亡的關鍵因素之一是在細胞凋亡的早期，CRT快速大量轉(zhuǎn)位到細胞膜表面表達[10]。本研究中5 μg/L力達霉素處理Caski細胞48 h，AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測可見AnnexinV 單染細胞顯著增多；免疫熒光流式細胞術(shù)檢測此時的腫瘤細胞膜表面CRT表達量顯著增加，從對照組的2.31%增加到54%。上述結(jié)果表明，力達霉素能有效誘導人宮頸癌Caski細胞發(fā)生凋亡，促使凋亡早期細胞的CRT向細胞膜表面轉(zhuǎn)移。提示力達霉素有誘導人宮頸癌Caski細胞發(fā)生免疫原性凋亡的可能性。

綜上所述，力達霉素能有效抑制人宮頸癌Caski細胞的增殖，其作用機制與調(diào)控Bcl-2基因家族的表達，活化線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡相關；同時，力達霉素能誘導CRT轉(zhuǎn)位到Caski細胞膜表面，使之成為可能具有免疫原性的凋亡細胞。提示力達霉素有誘導人宮頸癌Caski細胞發(fā)生免疫原性凋亡的可能。此現(xiàn)象為本實驗室首次發(fā)現(xiàn)，為力達霉素抗腫瘤臨床治療提供了新的思路和理論依據(jù)。

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[收稿2016-01-05修回2016-02-22]

(編輯張曉舟)

Immunogenic apoptosis of human Caski cervical cancer cells induced by Lidamycin

WANG Fa-Ling,QIN YE,CAO Chun-Yu,LI Qian,WANG Yan-Lin，YANG Jian-Lin.

Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,Three Gorges University Medical College，Yichang 443002,China

Objective:To investigate effects of Lidamycin (LDM,C-1027) on the proliferation and immunogenic transform of human Caski cervical cancer cells and to provide the basic experiment data and theoretical supports for establishment of the new immunotherapy method mediated by LDM.Methods: MTT was used for the analysis of cell proliferation;apoptosis rate was analyzed by flow cytometry;Western blot was used to analyze the effect of LDM on the expression of Bax and Bcl-2 in Caski cells；the Flow cytometry was used to detect the expression of Calreticulin (CRT) on the cell surface.Results: Lidamycin inhibited proliferation of Caski cells significantly in the time- and dose-dependent manners;The apoptotic cell ratio induced by 5 μg/L Lidamycin was 11.5% ,Comparing with the control group,Lidamycin treatment increased Bax but decreased Bcl-2 contents significantly within Caski cells,it also significantly increased the expression of CRT on the cell surface of Caski cells from 2.31% to 67.2%.Conclusion: Lidamycin has pharmacological activity in inhibiting proliferation of the human cervical Caski cells and the underlying mechanism is related with inducing the intrinsic mitochondrial pathway of apoptosis.In the same time,Lidamycin can increase the expression of CRT on the cell surface,so it may have the ability to promote the immunogenic apoptosis of tumor cells.

Lidamycin;Caski cells;Immunogenic apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.006

①本文為國家自然科學基金資助項目(81372265)。

王發(fā)玲(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事抗腫瘤分子靶點與免疫治療研究。

及指導教師：楊建林(1975年-)，女，副教授，主要從事抗腫瘤免疫與分子生物學研究，E-mail: mmgbb2002@126.com。

R73

A

1000-484X(2016)10-1437-04