吉西他濱對人非小細胞肺癌HCC827活性和凋亡的影響

張婧婧　趙慶偉　楊景瑞　段巨洪　于海川

(河南省新鄉醫學院醫學檢驗學院分子診斷與醫學檢驗技術河南省協同創新中心，新鄉453003)

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吉西他濱對人非小細胞肺癌HCC827活性和凋亡的影響

張婧婧趙慶偉楊景瑞段巨洪于海川

(河南省新鄉醫學院醫學檢驗學院分子診斷與醫學檢驗技術河南省協同創新中心，新鄉453003)

目的：研究吉西他濱對人非小細胞肺癌HCC827細胞活性以及凋亡的影響，以及與Bcl-2表達的關系。方法：采用cell counting kit-8法、細胞核Hochest33258染色法、流式細胞儀Annexin V-FITC/PI 雙染法等多種方法，體外研究吉西他濱對人非小細胞肺癌HCC827的活性、凋亡和細胞周期的影響；采用Western blot法，觀察藥物作用后細胞中Bcl-2蛋白表達的變化。結果：吉西他濱(0.1～1 000 ng/ml)對人非小細胞肺癌HCC827活性具有抑制作用，并有促凋亡效應。此外，可以將細胞阻滯在S期。在吉西他濱誘導的細胞凋亡過程中，凋亡因子Bcl-2蛋白的表達下調。結論：吉西他濱可以抑制人非小細胞肺癌HCC827細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，S期周期阻滯，其誘導的凋亡可能是其殺死腫瘤細胞的主要機制之一，此外，凋亡與相關基因Bcl-2蛋白的表達具有一定關系。

細胞凋亡；人非小細胞肺癌HCC827細胞；吉西他濱；Bcl-2蛋白

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其總發病數占全部惡性腫瘤發病數的21%左右，而死亡數占總癌癥死亡數的24%左右，并呈明顯上升趨勢[1,2]。在所有的肺癌病例中，70%～80%為非小細胞肺癌(NSCLC)[3，4]。目前臨床上化療仍然是非小細胞肺癌的傳統治療方法。

在上個世紀90年代，臨床上出現了一批治療肺癌的細胞毒藥物如紫杉醇、長春瑞濱、吉西他濱等[5-7]。而其中吉西他濱(Gemcitabine，GEM)是對NSCLC最有效果的化療藥物之一[8]。GEM 為去氧胞苷的衍生物，其結構和代謝均與阿糖胞苷相似，屬抗代謝類抗癌藥，1996年被美國FDA批準為非小細胞肺癌和胰腺癌的一線化療藥物[9,10]。有研究報道吉西他濱的抗腫瘤可能是通過誘導細胞凋亡達到殺死肺癌細胞的，但具體機制尚不清楚。Bcl-2是一種非常強的凋亡拮抗基因，Bcl-2蛋白能夠阻斷細胞凋亡，進一步誘導腫瘤的發生與發展[11,12]。本研究主要是考察吉西他濱對人非小細胞肺癌HCC827細胞的凋亡作用以及凋亡相關因子Bcl-2蛋白在吉西他濱誘導的細胞凋亡中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑吉西他濱(CAS號：95058-81-4，含量≥98.9%)購自北京諾其雅生物科技有限公司；RPMI1640 培養基，小牛血清購自Gibco公司；Bcl-2單克隆抗體(Trevigen，美國)購于艾美捷科技有限公司；cell counting kit-8(CCK-8)試劑(DOJINDO，日本)盒購自上海華雅思創生物科技有限公司；Hochest 33258染色試劑盒(KEYGEN)購自南京凱基生物科技發展有限公司；AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒(Invitrogen，美國)購自重慶市華雅干細胞技術有限公司；Western blot 所用試劑均購自北京信諾金達生物科技有限公司。

1.1.2儀器恒溫恒濕細胞培養箱(Thermo Scientific，美國)購自上海輔澤商貿有限公司；多功能酶標儀(Hidex，芬蘭) 購自東樂自然基因生命科學公司；流式細胞儀(HPC-100，加拿大)購自普瑞麥迪(北京)實驗室技術有限公司；熒光顯微鏡(XY40S)購自香港先達分析儀器有限公司；近紅外雙色激光成像系統 (Licor Biosciences) 來自于美國Odyssey公司。

1.1.3細胞株人非小細胞肺癌細胞HCC827，為上皮細胞樣細胞，由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

1.2實驗方法

1.2.1細胞株培養HCC827細胞培養在RPMI1640培養液(含10%小牛血清)中，并置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養箱中培養。細胞長滿培養瓶的70%～80%時，用0.25%的胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化，然后放培養箱中傳代培養。

1.2.2細胞活性檢測取對數生長期的HCC827細胞，胰酶消化后制成1×105ml-1的細胞懸液，取100 μl接種于96孔板中，每組設4個平行孔。待貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱，分別置培養箱中孵育24、48、72 h。吸出含藥培養液，加入含10%CCK-8的新鮮培養液，繼續在培養箱中孵育15～30 min，以不含藥物的細胞做為空白對照組，然后用酶標儀檢測450 nm吸光度值(A450)。細胞活性(%)=實驗組平均A450值÷對照組平均A450值×100%。

1.2.3細胞核形態學觀察取對數生長期的HCC827細胞，用 0.25%胰酶消化后，以 1×105孔-1的密度接種于6孔板中，加入不同濃度藥物處理48 h后，去掉舊培養液，加入含10 μg/ml Hochest 33258的細胞培養液染色20～30 min，然后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗三遍，再加入適量PBS。用熒光顯微鏡觀察細胞核的形態。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期藥物處理HCC827細胞48 h后，用胰酶消化細胞后，將細胞分散均勻，然后收集細胞。先用1 000 r/min離心5 min，去掉上清培養基。再加入1 ml 4℃預冷的乙醇(70%)，用移液槍混勻。4℃固定過夜，為了除去乙醇，通過1 000 r/min離心5 min，去掉上清，然后加適量RNA酶，37℃中水浴1 h，將細胞分成兩組：第一組，加入0.5 mg/L碘化丙啶(PI)及Annexin V-FITC在冰浴中染色10～20 min，最后上流式細胞儀檢測。采用Cell Quest軟件分析細胞凋亡率；第二組，將離心固定的細胞用PI避光染色25 min，于流式細胞檢測細胞周期，并分析統計細胞周期比例。

1.2.5Western blot檢測Bcl-2蛋白表達取對數生長期HCC827細胞，胰酶消化后分散均勻，以5×105ml-1的密度接種到6孔板中，每孔1 ml細胞混懸液。待細胞貼壁后，給予不同濃度的吉西他濱藥物作用48 h，消化細胞并收集，用4℃預冷的PBS洗滌，再通過蛋白裂解液4℃裂解細胞20 min，隨后用12 000 r/min在4℃下離心20 min，收集上清液，即為細胞總蛋白，用Bradford法進行蛋白含量測定。蛋白變性后，以50 μg進行SDS-PAGE電泳(10%分離膠，5% 濃縮膠)。電泳結束后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%PBST牛血清白蛋白封閉液封閉，再進行Bcl-2相應抗體孵育，最后采用近紅外雙色激光成像系統進行成像和蛋白含量檢測。

2　結果

2.1細胞活性檢測結果如表1所示，0.1～1 000 ng/ml的吉西他濱分別作用24、48、72 h后對HCC827細胞的活性均有一定的抑制作用，并且呈濃度和時間依賴性 (P<0.05)。

2.2細胞核形態學觀察結果如圖1所示，對照組的HCC827細胞核形態完整，0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱分別處理HCC827細胞48 h后，細胞出現染色質濃縮、細胞核固縮、凋亡小體等凋亡特點，而且隨著藥物濃度的增加，凋亡現象更明顯。

2.3細胞凋亡率檢測結果如圖2所示，細胞經過0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，細胞主要分布在Q2和Q3區，而Q2區為細胞凋亡區。經過統計分析，如表2所示，作用72 h后，0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理的細胞的凋亡率分別為(3.5±1.2)%、(20.9±1.5)%、(43.9±2.1)%、(84.6±2.5)%，隨著藥物濃度增加細胞凋亡增加。

2.4細胞周期檢測結果如表3所示，細胞經過0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，G0/G1期細胞比例不斷下降，而S期細胞比例不斷上升，對細胞周期有明顯影響，將細胞阻滯在S期。

Cellviability(%)0ng/ml0.1ng/ml1ng/ml10ng/ml100ng/ml1000ng/ml24h100±3.697.6±1.993.6±1.31)68.6±1.51)49.9±2.41)30.6±4.21)48h100±2.883.9±5.11)89.9±2.21)53.6±2.11)33.6±2.81)20.1±1.81)72h100±2.380.8±4.61)76.9±3.31)46.5±3.21)26.9±1.11)11.3±3.41)

Note：1)P<0.05,compared with the 0 ng/ml control group in the same treating time.

圖1　細胞核Hoechst33258熒光染色結果Fig.1　Result of nucleus Hoechst33258 staining

圖2　流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.2　Apoptosis detected by flow cytometry

圖3　Western blot檢測Bcl-2蛋白表達情況Fig.3　Bcl-2 protein expression detected by Western blot

GEMconcentration(ng/ml)00.1101000Apoptosisrate(%)3.5±1.2%20.9±1.5%1)43.9±2.1%1)84.6±2.5%1)

Note：1)P<0.05,compared with 0 ng/ml control group.

Cellcycle(%)G0/G1SG2/M052.1±2.427.9±1.220±2.90.150.6±3.132.5±2.816.9±1.61043.1±2.11)38.4±1.51)18.5±2.8100026.9±2.62)60.9±1.82)12.2±4.2

Note：1)P<0.05，2)P<0.01,compared with 0 ng/ml control group intra-group.

表4Bcl-2蛋白表達水平統計結果

Tab.4Statistical results of Bcl-2 protein expression

GEMconcentration(ng/ml)00.1101000Bcl-2level260.9±8.9231.1±4.91)162.9±9.71)46.9±8.31)

Note：1)P<0.05,compared with 0 ng/ml control group.

2.5Bcl-2蛋白表達水平檢測如圖3所示，經灰度分析，0、0.1、10、1 000 ng/ml吉西他濱處理48 h后，細胞中Bcl-2蛋白灰度值逐漸降低。經過統計分析得出結果如表4所示，Bcl-2的表達水平隨著藥物濃度的提高而逐漸下降，與0 ng/ml空白對照組相比存在統計學差異(P<0.05)。

3　討論

非小細胞肺癌最常見的、死亡率很高的一種惡性腫瘤。吉西他濱目前已被臨床證實為治療非小細胞肺癌高效低毒的藥物之一，已有文獻報道其抗腫瘤的機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡方式，通常它是在嚴密調控的基因介導發生的主動自殺的過程。腫瘤細胞的凋亡及其相關基因調控過程已成為了國際腫瘤研究的一個熱點[13，14]。

本課題中，我們考察了吉西他濱對HCC827細胞凋亡的影響。通過細胞活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測，發現吉西他濱可以明顯的抑制HCC827細胞的增殖活性。通過細胞核特異性染料Hochest33258染色法可以觀察到HCC827細胞凋亡的細胞核形態學變化。藥物處理后，細胞核出現固縮和片段化，這可能是細胞凋亡過程中出現的凋亡小體。通過流式細胞術雙染法，測得細胞的凋亡率為(3.5±1.2)%、(20.9±1.5)%、(43.9±2.1)%、(84.6±2.5)%。以上結果可以發現，吉西他濱可以誘導HCC827細胞發生明顯的凋亡，是一種有效的治療非小細胞肺癌的藥物。但是吉西他濱誘導的凋亡過程涉及了哪些凋亡蛋白是值得研究的問題。

Bcl-2 家族蛋白質在細胞凋亡的調控過程中起到了非常重要的作用[15,16]。有研究證實，Bcl-2 家族蛋白可以影響PT通道(可以無選擇性地允許≤1.5 kD 分子通過)開放及其細胞色素C(Cyto-c)、凋亡誘導因子(AIF)的釋放，還可以改變線粒體膜的通透性[17-19]。Bcl-2蛋白表達上調的話，會阻止細胞凋亡的發生，提高細胞的存活率，而Bcl-2蛋白下調的話，將促進細胞凋亡[20]。在本研究中，我們采用 Western blot法，來檢測吉西他濱處理細胞前后，Bcl-2蛋白表達的變化。實驗結果發現，吉西他濱作用HCC827細胞后，Bcl-2蛋白的表達下調。因此，我們推測這可能是Bcl-2蛋白的下調影響了PT通道的開放以及Cyto-c、AIF的釋放、線粒體外膜的通透性，從而促進了HCC827細胞的凋亡。

綜上所述，本研究發現吉西他濱具有顯著抑制非小細胞肺癌HCC827細胞體外活性的效果，其抗腫瘤機制可能與誘導細胞凋亡以及細胞周期S期阻滯有關，此外，凋亡因子Bcl-2蛋白在吉西他濱誘導的凋亡過程中起到了一定的作用。

[1]陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等.2011年中國惡性腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤,2015,24(1):1-10.

[2]Lortet-Tieulent J,Soerjomataram I,Ferlay J,etal.International trends in lung cancer incidence by histological subtype:adenocarcinoma stabilizing in men but still increasing in women[J].Lung Cancer,2014,84(1):13-22.

[3]Wu YL,Zhou C,Hu CP,etal.Afatinib versus cisplatin plus gemcitabine for first-line treatment of Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring EGFR mutations (LUX-Lung 6):an open-label,randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2014,15(2):213-222.

[4]郝利國,申寶忠,李任飛,等.中晚期非小細胞肺癌聯合治療進展[J].中國全科醫學,2013,15(33):3812-3815.

[5]劉維,羅以.晚期非小細胞肺癌的治療進展[J].現代醫藥衛生,2015,12(7):1033-1036.

[6]李懷.吉西他濱聯合順鉑治療晚期非小細胞肺癌的臨床效果觀察[J].中國當代醫藥,2014,6(24):110-112.

[7]鄭慧.吉西他濱聯合多西紫杉醇新輔助化療方案在局部晚期肺癌的療效觀察[J].中國實用醫藥,2014,9(24):143-144.

[8]李蔚,肖邦榕.吉西他濱(Gemcitabine)聯合鉑類藥物治療老年中晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的臨床觀察[J].華西醫學,2004,19(1):13-14.

[9]鄭建軍,賈林.吉西他濱治療胰腺癌的臨床和實驗研究進展[J].中華胰腺病學雜志,2008,11(2):140-142.

[10]尤長宣,羅榮城.治療非小細胞肺癌的新藥吉西他濱[J].國際腫瘤學雜志,2000,12(5):309-311.

[11]都鎮先,張海燕,鄧娓娓,等.微小RNA干擾Bcl-2相關抗凋亡基因2抑制蛋白酶體抑制劑對甲狀腺癌細胞凋亡誘導作用的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(16):1241-1243.

[12]Czabotar PE,Lessene G,Strasser A,etal.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family:implications for physiology and therapy[J].Nat Rev Mol Cell Bio,2014,15(1):49-63.

[13]Lau JK,Brown KC,Dom AM,etal.Capsaicin induces apoptosis in human small cell lung cancer via the TRPV6 receptor and the calpain pathway[J].Apoptosis,2014,19(8):1190-1201.

[14]趙彥超,顧耘.細胞凋亡通路研究進展[J].現代醫學,2013,5(4):285-288.

[15]柳向軍,張令強,劉小林,等.細胞凋亡中的Bcl-2家族蛋白及其BH3結構域的功能研究[J].生物化學與生物物理進展,2006,6(3):221-225.

[16]朱玉山,盧鐵元,王蕊,等.Bcl-2家族蛋白調控線粒體膜通透性和細胞色素C釋放的新機制[J].生命科學,2011,14(11):1076-1080.

[17]叢義梅,劉鵬,金大鵬,等.Bcl-2家族與細胞凋亡的關系[J].中華醫學研究雜志,2008,8(2):125-127.

[18]張旭.Bcl-2蛋白家族在PT孔開放中的作用[J].實用腫瘤學雜志,2011,25(2):175-178.

[19]Siddiqui WA,Ahad A,Ahsan H.The mystery of BCL2 family:Bcl-2 proteins and apoptosis:an update[J].Arch Toxicol,2015,89(3):289-317.

[20]張克君,孫傳東,李德春.p53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表達與細胞凋亡的關系[J].Chinese J Surg Oncol,2010,13(2):102-107.

[收稿2016-01-25修回2016-03-09]

(編輯許四平)

Effect of Gemcitabine on viability and apoptosis of non-small cell lung cancer HCC827 in vitro

ZHANG Jing-Jing,ZHAO Qing-Wei,YANG Jing-Rui,DUAN Ju-Hong,YU Hai-Chuan.

Collaborative Innovation Center of Henan Province,Institute of Medical Laboratory Scinence and Molecular Diognostics and Medical Laboratory Technology,Xinxiang 453003,China

Objective:To observe the effect of Gemcitabine (GEM) on the viability and apoptosis of non-small cell lung cancer HCC827 in vitro.Methods: The cell viability,apoptosis and cell cycle of HCC827 cells induced by Gemcitabine were detected with cell counting kit-8 assay (CCK-8),Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry.The expression of Bcl-2 protein of cells treated with GEM was examined by Western blot assay.Results: There was significant inhibition effect on HCC827 cells treated with 0.1-1 000 ng/ml of GEM,which can promote the occurrence of HCC827 cell apoptosis and arrest cell in the S phrase.The apoptosis induced by GEM was accompanied with the down regulation of Bcl-2 protein.Conclusion: GEM can inhibit the cell viability and induce the HCC827 cell apoptosis and S phrase arrest.Its cell dead type was apoptosis,which was related with the expression of Bcl-2 protein.

Cell apoptosis;Human non-small cell lung cancer HCC827 cell;Gemcitabine;Bcl-2 protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.009

張婧婧(1982年-)，女，碩士，實驗師，主要從事分子免疫學研究。

及指導教師：于海川(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事造血免疫分化方面的研究。

R734.2

A

1000-484X(2016)10-1450-04