升陷湯治療實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠免疫機制研究①

許駿堯　朱　潔　程　楊　吳周燁　陳以狄　夏寶妹　吳顥昕

(南京中醫藥大學基礎醫學院，南京210046)

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升陷湯治療實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠免疫機制研究①

許駿堯朱潔程楊吳周燁陳以狄夏寶妹吳顥昕

(南京中醫藥大學基礎醫學院，南京210046)

目的：探討升陷湯治療實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠的免疫機制。方法：采用人工合成鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段加完全弗氏佐劑免疫Lewis大鼠構建EAMG,經評估確定建模成功25只。將這25只大鼠隨機分為模型對照組，陽性藥物組(強的松組)，升陷湯低、中、高劑量組。觀察該方對模型大鼠臨床評分、體重、低頻重復電刺激(RNS，5 Hz)衰減率、血清中乙酰膽堿抗體(AChR Ab)含量及TGF-β、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17水平的影響。結果：造模后各組較佐劑對照組RNS衰減率明顯增大(P<0.01或P<0.05)，且均超過10%，體重進行性下降，并出現典型肌無力樣癥狀，證明造模成功。給藥治療后，升陷湯低、中、高劑量組大鼠RNS衰減率均顯著降低(P<0.01)，體重下降均減緩，癥狀好轉。與模型對照組相比，升陷湯低、中、高劑量組血清AChR Ab含量均降低(P<0.05)，TGF-β水平均升高，IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17水平均降低(P<0.01或P<0.05)。結論：升陷湯可使RNS衰減好轉，改善EAMG大鼠體重持續下降趨勢，并使體重增加趨勢升高，其機制可能是上調TGF-β水平，下調IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17的水平，抑制B細胞產生AChR Ab，降低血清AChR Ab含量，減少對NMJ處AChR的損害，從而起到治療EAMG的作用。

升陷湯；實驗性自身免疫性重癥肌無力；AChR Ab；細胞因子

重癥肌無力(Myasthenia gravis,MG)是在細胞免疫依賴性補體參與下，由乙酰膽堿受體抗體(Acetylcholine receptor antibody,AChR Ab)介導而產生的自身免疫系統疾病。目前西醫主要使用膽堿酯酶抑制劑、激素、免疫抑制劑、胸腺切除術等方法進行治療，而現代中醫在治療上多提倡從脾胃或者奇經論治，治法有健脾益氣、補中升陽、補益脾腎、疏肝通絡化瘀等多種。

升陷湯出自清代醫家張錫純的《醫學衷中參西錄》，方用黃芪、知母、柴胡、升麻、桔梗，是益氣升提治法的代表方，且在國內已有用于治療MG的報道，療效較好[1,2]。本研究旨在通過升陷湯治療實驗性自身免疫性重癥肌無力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠的實驗，初步揭示其治療MG的免疫學機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雌性6～8周齡Lewis大鼠40只，體重130～150 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號碼：SCXK(滬)2013-0016]，飼養于南京中醫藥大學中醫腦病實驗室SPF級動物實驗室。

1.1.2試劑鼠源性乙酰膽堿受體-α亞基97-116肽段序列(The rat sequence 97-116 of the AChR α subunit，Rα97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由杭州中肽生化有限公司提供。完全弗氏佐劑(Complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s adjuvant，IFA)、磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)均購自美國Sigma公司；H37Ra干粉購自美國Difco Bacto公司；大鼠乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠轉化生長因子β(TGF-β)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-17 ELISA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.1.3藥物強的松片(規格5 mg/片，上海信誼藥廠有限公司，批號：018150306)由江蘇省無錫市中醫醫院提供；升陷湯浸膏含中藥黃芪18 g、知母9 g、柴胡4.5 g、升麻3 g、桔梗4.5 g，浸膏含生藥1.26 g/ml，由南京中醫藥大學藥學院制備。

1.2方法

1.2.1建立EAMG模型參照Baggi等[3]和Na等[4]的方法構建EAMG大鼠模型。具體方法：實驗第1天于造模組大鼠肩背部與尾基部多點注射與CFA充分混勻的乳劑200 μl(含Rα97-116 50 μg、H37Ra干粉1 mg)；佐劑對照組注射等量PBS與CFA混合乳劑，并在第30天和第45天于同部位多點注射與IFA充分混勻的乳劑200 μl(含Rα97-116 50 μg)以強化免疫，佐劑對照組注射等量PBS與IFA混勻的乳劑。

1.2.2模型評估采用體重和Lennon分級法對模型進行評估。①體重：實驗期間每周2次稱重。②按 Lennon等[5]的分級法將癥狀嚴重程度分為 4 級。0級： 沒有肯定的無力表現；1級：撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且易疲勞；2級：明顯無力，休息時身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動作笨拙，行走不穩；3級：嚴重無力表現，無撕咬動作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。癥狀在4級之間者,分別打0.5、1.5、2.5分。

1.2.3分組及給藥將經模型評估成功的EAMG大鼠共25只隨機分為模型對照組，陽性藥物組(強的松組)，升陷湯低、中、高劑量組，每組5只。給藥劑量根據人體體表面積計算給藥劑量，相當于成人等效劑量的8倍，其等效劑量為中劑量，中劑量的1/2為低劑量，中劑量的2倍為高劑量。灌胃給藥體積為1 ml/100 g。模型對照組給予生理鹽水灌胃；陽性藥物組給予強的松5.4 mg/(kg·d)(純水溶解)灌胃；升陷湯低劑量組給予浸膏2.6 g/(kg·d)，中劑量組給予5.2 g/(kg·d)，高劑量組給予10.4 g/(kg·d)灌胃。

1.2.4低頻重復神經電刺激(Repetitive nerve stimulation,RNS)檢測用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射，將大鼠麻醉后固定于解剖板上，將刺激電極以2～3 mm 距離插至坐骨切跡附近肌肉內，參考電極插入腹部皮下，一根記錄電極置于同側腓腸肌內側頭，另一根記錄電極置于跟腱附著處,分別給以5 Hz連續10次的低頻電刺激，移動電極，重復操作3次[6]。計算第1個與第5個動作電位的衰減率D，衰減率D=(第1個動作電位-第5個動作電位)/第5個動作電位，大于10%者為陽性。

1.2.5血清AChR Ab及細胞因子的ELISA檢測造模結束后采用尾靜脈取血，取血后靜置30 min，3 000 r/min，4℃離心15 min，取上層血清，放置-20℃冷凍保存。給藥結束后采用頸動脈取血，取血清-20℃冷凍保存。采用AChR Ab、TGF-β、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17 ELISA試劑盒檢測各個指標，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。其中AChR Ab檢測以P/N為評價指標，P/N=(待測樣品OD值-空白孔OD值)/(陰性對照品OD值-空白孔OD值)。其值大于2.1為陽性，小于1.4為陰性，介于兩者之間為假陽性。

2　結果

2.1造模后大鼠的一般狀況與評估第1次免疫后1個月左右，造模組大鼠體重增長逐漸減緩，并出現活動減少，毛發變暗等癥狀。第2次免疫后大部分造模組大鼠出現了體重增長停滯或下降，毛發枯燥，動作減緩，叫聲低弱。第3次免疫后造模組體重已顯著低于佐劑對照組，并伴有以上癥狀不同程度加重。3次免疫后兩周，采用Lennon評分、ELISA檢測血清AChR-Ab含量和檢測肌電圖的方法對造模組大鼠進行模型評估。取Lennon評分大于1分，血清AChR Ab檢測為陽性，低頻重復電刺激衰減率大于10%的25只為造模成功大鼠，成模率71.4%。

2.2RNS衰減率由表1可見，造模后除佐劑對照組外，各組衰減率均明顯增大(P<0.01或P<0.05)，且均大于10%為陽性，說明造模后大鼠出現了肌電衰減，符合EAMG造模標準。給藥治療后各治療組大鼠RNS衰減率均顯著減小(P<0.01)，低于10%，升陷湯低、中、高劑量組與強的松組比較衰減率略低，無顯著差異性(P>0.05)。說明升陷湯和強的松均能明顯改善EAMG大鼠肌電衰減，使其轉為陰性。

GroupsnThedecrementpercentageofRNSbeforetreatmentThedecrementpercentageofRNSaftertreatmentCFA58.27±1.427.99±1.71EAMGmodel514.23±2.352)12.96±1.13Positivecontrol511.98±1.041)8.59±1.193)Lowdosegroup513.64±1.542)6.81±1.223)4)Mediumdosegroup515.54±2.712)8.14±1.553)4)Highdosegroup513.35±3.062)5.81±2.663)4)

Note：Compared with CFA，1)P<0.05,2)P<0.01；compared with EAMG model，3)P<0.01；compared with positive control，4)P>0.05.

2.3ELISA檢測大鼠血清AChR Ab水平由圖1可見，治療前，各組與佐劑對照組比較，AChR Ab含量均顯著升高(P<0.01或P<0.05)；治療后，與模型對照組相比，強的松組和升陷湯三個劑量組均降低(P<0.05)。與治療前相比，強的松組和升陷湯高劑量組AChR Ab含量顯著降低(P<0.01)，而低、中劑量組亦降低(P<0.05)。

2.4治療后ELISA檢測大鼠血清TGF-β、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17的水平由表2可見模型組與佐劑對照組比較，IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17水平顯著升高(P<0.01)，而TGF-β水平則降低(P<0.05)。升陷湯三個劑量組與模型對照組相比IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17水平均顯著降低(P<0.01或P<0.05)；升陷湯三個劑量組與模型對照組比較TGF-β水平均升高(P<0.05)。升陷湯三個劑量組IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17水平低于強的松組(P<0.05或P<0.01或P>0.05)；升陷湯中劑量組TGF-β水平高于強的松組(P<0.05)，而低、中劑量組略高于強的松組，無顯著差異性(P>0.05)。

圖1　各組大鼠血清AChR Ab含量檢測(pmol/L)Fig.1　Titer of AChR Ab in serum of each group rats(pmol/L)Note: Compared with CFA，*.P<0.05，**.P<0.01；compared with EAMG model，#.P<0.05，##.P<001；after treatment compared with before treatment，△.P<0.05，△△.P<0.01.

GroupsnIFN-γIL-2IL-4IL-17TGF-βCFA5643.5±25.12)516.1±75.22)33.7±1.52)38.1±1.92)100.9±4.51)EAMGmodel5778.6±7.4686.5±31.1141.5±3.250.8±1.983.1±3.5Positivecontrol5728.4±20.91)540.3±35.81)39.6±2.71)45.7±2.81)98.6±9.61)Lowdosegroup5667.9±26.132)5)469.9±38.92)3)35.2±2.42)4)42.9±1.52)3)98.7±3.91)3)Mediumdosegroup5657.8±26.22)5)481.2±52.22)5)34.6±2.12)5)42.2±2.52)4)99.3±12.61)4)Highdosegroup5639.±21.72)5)485.1±57.52)5)34.9±2.12)4)43.8±1.71)3)98.3±3.91)3)

Note：Compared with EAMG model，1)P<0.05,2)P<0.01；compared with positive control，3)P>0.05,4)P<0.05,5)P<0.01.

圖2　治療后各組大鼠體重(g)Fig.2　Weight of each group rats with medication(g)

2.5治療后各組大鼠體重變化由圖2可見，給藥后(第9周)，升陷湯三個劑量組和強的松組大鼠體重下降均減緩,而模型對照組體重持續下降，至實驗結束體重明顯低于各給藥組(P<0.01)。說明升陷湯和強的松均可改善EAMG大鼠體重持續下降趨勢，而使體重增加趨勢升高。

3　討論

MG作為一種自身免疫性疾病其發病機制較為復雜，目前認為，體液及細胞免疫、多種抗體、補體及細胞因子等均參與了MG的發病過程。其發病的關鍵是機體產生了針對位于神經肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)處AChR的異常免疫應答，受誘導活化的B淋巴細胞轉化為漿細胞并分泌AChR Ab,后者可通過：①阻斷ACh與AChR結合或使離子通道關閉；②結合AChRs致使其內吞、降解或退化；③激活補體，形成膜攻擊復合物，破壞NMJ處突觸后膜等途徑影響神經與肌肉功能[7]。本實驗中，與佐劑對照組相比造模后各組大鼠血清AChR Ab含量均顯著增高(P<0.01或P<0.05)，且出現體重進行性下降，肌無力樣表現等伴隨癥狀，說明本實驗所采用的Rα97-116雖僅為AChR的一小部分但其含有能引起MG的抗原決定簇，具備高度的免疫原性，可誘導機體產生特異性免疫應答，成功構建EAMG模型，成模率71.4%，與國內外同類研究報道相一致。給藥治療后，各組大鼠血清AChR Ab含量均降低(P<0.05)，其中升陷湯三個劑量組略低于強的松組，無顯著差異性(P>0.05)。而與治療前相比，強的松組和升陷湯高劑量組降低更為顯著(P<0.01)。提示升陷湯和強的松均可降低AChR Ab含量，從而起到治療MG的作用，并且高劑量的升陷湯比低、中劑量降低更為顯著。

由Th1細胞分泌的IFN-γ、IL-2與促炎反應和細胞毒反應密切相關[8]。IFN-γ可促進T、B細胞的增殖和活化，分泌自身抗體，放大免疫應答[9]。而在MG患者和動物模型中，IFN-γ均顯著升高，對促進MG起重要作用。研究表明給予EAMG大鼠IFN-γ(rrIFN-γ)皮下注射后MG癥狀加重[10]，而IFN-γ或IFN-γ受體基因敲除的EAMG小鼠癥狀較輕[11]。此外Tuzun等[12]還證實IFN-γ可誘導特異性B細胞成熟并分泌AChR Ab，且兩者表達水平呈正相關。類似的，IL-2可促進IFN-γ的產生，其在MG患者中呈現高表達，而降低血清中IL-2的水平可使AChR Ab降低[13]。本實驗中，模型對照組相比佐劑對照組血清IFN-γ與IL-2水平顯著升高(P<0.01)，說明EAMG大鼠體內出現了免疫失衡，兩者可能均起到了促進MG發病的作用。給藥治療后，各組大鼠血清IFN-γ與IL-2水平均降低(P<0.01或P<0.05)，說明升陷湯和強的松均可使IFN-γ與IL-2水平降低，從而降低AChR Ab水平，這可能是升陷湯治療EAMG的主要機理之一。相比強的松組，升陷湯三個劑量組尤其中、高劑量組降低更為顯著(P<0.01)，說明升陷湯的免疫干預作用明顯強于強的松。

由Th2細胞分泌的IL-4可刺激B細胞活化增殖，并在抗體分泌及其類型轉換中起到關鍵作用，但其在MG發病過程中的作用目前仍存在爭議。Ostlie等[14]發現IL-4基因敲除小鼠相比對照組血清AChR Ab出現更早而持久，肌無力癥狀也更重。另有在MG患者中存在IL-4下降的報道[15]。而相反的，有研究認為AChR Ab的產生主要受IL-4調控，IFN-γ作為協同因子可增強其作用[16]。Shandley等[17]也證實IL-4可通過促使生成IL-15刺激Th1細胞及B細胞活化，從而促進MG的發生。本實驗中，升陷湯三個劑量組血清IL-4水平顯著低于模型對照組(P<0.01)，提示降低IL-4水平可能是升陷湯參與免疫調節，治療MG的一種方式，而其具體作用機制仍需進一步研究。

IL-17由一種新發現的參與免疫調節反應的Th細胞——Th17細胞分泌。有研究表明MG血清AChR Ab水平與IL-17呈正相關，對MG發病起促進作用[18]。而Bai等[19]證實在此過程中IL-17的作用甚至強于IFN-γ。本實驗中，造模后血清IL-17水平顯著升高(P<0.01)，而治療后各組均降低(P<0.01或P<0.05)，說明升陷湯和強的松亦可通過降低血清IL-17下調AChR Ab水平，起到調節免疫系統，治療MG的作用。另外值得注意的是，在升陷湯三個劑量組中，中劑量組而非高劑量組IL-17水平最低，且顯著低于強的松組(P<0.01)，提示升陷湯作用的機理可能并非是單純的免疫抑制，而是調節免疫平衡，與原方等效劑量的升陷湯中劑量組能使血清IL-17水平恢復至最接近正常水平，效果優于低、高劑量組和強的松組。

Th3細胞分泌的TGF-β是體內主要的內源性免疫抑制性細胞因子。它被證實可通過抑制Th1、Th2細胞產生的IFN-γ、IL-4等，抑制AChR Ab的合成，具有預防EAMG發病的作用[20]，且有研究發現EAMG鼠癥狀的好轉往往伴隨著TGF-β水平的升高[21]。本實驗中，模型對照組血清TGF-β水平降低(P<0.05)，給藥治療后，各組大鼠血清TGF-β水平均升高(P<0.05)，說明EAMG發病后機體處于免疫亢進狀態，缺乏免疫抑制，而升陷湯和強的松均可升高TGF-β水平，發揮免疫抑制作用，從而起到治療MG的效果。與IL-17的實驗結果類似，升陷湯中劑量組血清TGF-β含量高于其他治療組且最接近正常水平，與強的松組比較具有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究提示升陷湯治療EAMG的機制可能是調節各細胞因子：升高TGF-β，下調IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17，恢復Th細胞之間的免疫穩態，從而抑制B細胞分化、增殖、合成分泌AChR Ab，減少對NMJ處AChR的損害，發揮治療MG作用，且在一定劑量范圍內，升陷湯免疫調節的功能更好。本研究為進一步探究升陷湯治療MG提供了免疫學依據。

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[收稿2015-12-09]

(編輯倪鵬)

Research on immune mechanism of Shengxian decoction in experimental autoimmune myasthenia gravis rats

XU Jun-Yao,ZHU Jie,CHENG Yang,WU Zhou-Ye,CHEN Yi-Di,XIA Bao-Mei，WU Hao-Xin.

Nanjing University of TCM,Nanjing 210046，China

Objective:To investigate the immune mechanism of Shengxian decoction in experimental autoimmune myasthenia gravis(EAMG) rats.Methods: Lewis rats were immunized with the rat sequence 97-116 of the AChR α subunit(Rα97-116) in CFA,25 of which were successful.They were randomly divided into 5 groups:EAMG model group,prednisone group(5.4 mg/kg),Shengxian decoction low,medium,high dose groups(dosage 2.6 g/kg,5.2 g/kg,10.4 g/kg).Clinical symptoms,weight,and the decrement percentage of RNS(5 Hz) were evaluated,and ELISA were adopted to determine the titers of AChR Ab,TGF-β,IFN-γ,IL-2,IL-4 and IL-17 in serum.Results: After molding,the percentage of decrement of RNS in each group noticeably increased by more than 10% in comparison with that in the CFA control group(P<0.01 orP<0.05).At the same time,they were also subjected to progressive decreasing weight and typical myasthenia symptoms,showing the successful molding.With medication,the decrement percentage of RNS of rats in the groups with low,medium and high dose of Shengxian decoction were all on obvious decline with alleviated weight decrease(P<0.01),testifying to the symptom improvement.Compared with the CFA control group,the groups with low,medium and high dose of Shengxian decoction were coupled with decreasing AChR Ab content(P<0.05),rising TGF-β level and reducing IFN-γ,IL-2,IL-4 and IL-17 level(P<0.01 orP<0.05).Conclusion: Shengxian decoction can turn the decrement percentage of RNS around,improve the progressive weight decrease in EAMG rats and increase the weight gains. By up-regulating the TGF-β level,lowering IFN-γ,IL-2,IL-4 and IL-17 level,preventing B cells from producing AChR Ab and reducing the content of AChR Ab in serum,it will soothe the damage of NMJ to AChR and cure EAMG.

Shengxian decoction;Experimental autoimmune myasthenia gravis;AChR Ab;Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.012

許駿堯(1993年-)，男，主要從事自身免疫系統疾病方面的研究，E-mail：296428835@qq.com。

及指導教師：吳顥昕(1965年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事心腦血管病及自身免疫系統疾病基礎與臨床研究，E-mail：wuhaoxin@sohu.com。

R285.5R392.11

A

1000-484X(2016)10-1462-05

①本文為2014年江蘇省大學生科技創新訓練計劃省級重點項目(201410315003Z)。