鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體的制備與鑒定①

米丹陽　段　睿　宋軍營　孫向東　張鐘允　閆　敏　袁　永　張振強　張改平　劉文第

(河南中醫藥大學中醫藥免疫學實驗室/鄭州市抗體組學重點實驗室,鄭州450046)

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·免疫學技術與方法·

鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體的制備與鑒定①

米丹陽段睿宋軍營孫向東張鐘允閆敏袁永張振強張改平②劉文第

(河南中醫藥大學中醫藥免疫學實驗室/鄭州市抗體組學重點實驗室,鄭州450046)

目的：探索以白細胞為免疫原的鼠抗人白細胞天然蛋白單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)制備與克隆篩選鑒定方法，制備鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體，并鑒定抗體性質。方法：用健康人外周血白細胞免疫小鼠，利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備mAbs，通過免疫細胞化學法對雜交瘤細胞進行非特異性陽性篩選，有限稀釋法進行亞克隆，應用免疫沉淀-質譜法進行mAb特異性鑒定，通過Western blot進行細胞株篩選，小鼠體內誘生腹水法制備單抗，親和層析法純化，ELISA間接法測定效價及親和力，Western blot進行特異性鑒定及交叉反應性分析，免疫組化染色人乳腺癌石蠟切片。結果：獲得免疫細胞化學檢測陽性多克隆細胞35孔，分泌鼠抗人S100A9蛋白單克隆抗體細胞株11株，優選1株制備腹水并純化鑒定抗體，抗體效價為1∶3.18×105，亞類為IgG1，輕鏈為kappa鏈，抗體純度達95%以上，親和力常數3.54×108L/mol，與S100A8的交叉反應率為0.12%,與S100A12和S100A13幾乎無交叉反應，組化染色識別人乳腺癌組織中的S100A9蛋白。結論：成功制備鼠抗人S100A9天然蛋白單克隆抗體，該單抗具有高效價、較高親和力和高特異性，能為其應用于免疫組化檢測S100A9蛋白的表達提供依據。

白細胞；S100A9；單克隆抗體；免疫學特性

白細胞是機體防御系統的重要組成部分，它通過吞噬、產生抗體和淋巴因子等方式來抵御和消滅入侵的病原微生物[1]。對白細胞相關蛋白的檢測，可以探索多種疾病的發病機理、病程、預后，具有很高的臨床和科研價值。本研究以健康人外周血白細胞為免疫原免疫BALB/c小鼠，利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備單抗，探索以白細胞為免疫原的鼠抗人白細胞天然蛋白mAb制備及克隆篩選鑒定方法。

S100A9是S100鈣結合蛋白家族的一個重要成員，又稱鈣粒蛋白B(Calgranulin B，CAGB)、骨髓相關蛋白-14(Myeloid related protein of molecular weight 14 kD，MRP-14)、遷移抑制因子相關蛋白-14(Migration inhibitory factor-related protein of molecular weight 14 kD，MRP14)等[2]。S100A9主要限制性地表達于單核/巨噬細胞系、中性粒細胞以及特定病理狀態下的角質化細胞中[3]。S100A9結合Ca2+、Zn2+、花生四烯酸、角蛋白中間絲、晚期糖基化終產物受體(RAGE)、Toll-樣受體4(TLR4)、基質金屬蛋白酶(MMPs)等，具有細胞內、外調節活性，參與炎癥反應和腫瘤發展過程[4]。S100A9蛋白的檢測對研究感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等多種疾病的發生、發展、治療、預后均有指導意義，以S100A9為靶點的藥物研發也成為國外研究的熱點。本研究成功制備了鼠抗人S100A9天然蛋白mAb，為S100A9蛋白檢測試劑盒的研發奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑健康人外周血經改良白膜法制備血小板過程中的白膜[5](富含白細胞)取自河南省紅十字血液中心成分室，6～8周齡的雌性BALB/c小鼠和小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0來自河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，人乳腺癌組織切片來源于河南省腫瘤醫院病理科。人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋)；HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(鄭州益康)；Protein G-Agarose(Santa Cruz，美國)；ECL化學發光試劑盒、Protein G親和層析柱(美國GE)；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(武漢三鷹)；重組人S100A9、S100A8、S100A12、S100A13蛋白(北京義翹神州)。

1.1.2儀器超靈敏化學發光成像儀、AKTATMpure分離純化系統(美國GE)；自動凝膠成像系統(英國UVItec)；免疫組化全自動染色機(德國Leica BOND Ⅲ)。

1.2方法

1.2.1單抗制備

1.2.1.1白細胞懸液的制備與小鼠免疫血液中心取回的新鮮白膜，用兩倍體積的PBS稀釋混勻，取50 ml離心管加10 ml淋巴細胞分離液，將20 ml稀釋的白膜緩慢平穩加于淋巴細胞分離液液面上，水平低溫離心機500 g、緩升緩降、18℃、離心20 min；收集環狀乳白色層至新的離心管中，洗滌重懸后計數并調整至所需濃度。經流式細胞技術檢測，淋巴細胞約占50%，單核細胞約占5%，粒細胞約占10%。上述白細胞懸液，以約1×106個細胞、200 μl背部皮下分點注射，免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫后第3、6、9周再次免疫，等量細胞腹腔注射。細胞融合前3 d以約1×107個細胞、300 μl腹腔注射加強免疫。收集每次免疫后小鼠血清，-20℃保存，免疫細胞化學法檢測免疫后血清抗體效價。

1.2.1.2免疫細胞化學檢測制備白細胞懸液，以每孔1×105個細胞，接種至96孔板中，無血清1640培養基37℃培養2 h，離心后吸取上清，V(甲醇)：V(雙氧水)=100∶1固定，棄上清，PBS-T(含0.05%的吐溫-20)洗4次，5%脫脂奶37℃封閉1 h，PBS-T洗4次。加一抗：免疫后小鼠血清或雜交瘤細胞培養上清100 μl/孔，37℃孵育1 h，棄上清，PBS-T洗4次；加二抗：100倍稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG，50 μl/孔，37℃孵育1 h，棄上清，PBS-T洗4次；AEC顯色液室溫避光顯色5～15 min，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.1.3細胞融合與亞克隆融合前2周復蘇SP2/0細胞，融合前2 d擴大培養。采取聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)化學融合法，SP2/0細胞與脾細胞的個數比例為1∶8～1∶10，使用HAT 1640完全培養基(含10%胎牛血清)。3～5 d可進行半數換液，7～10 d可過度到HT培養基，2周后可用1640完全培養基。密切觀察細胞生長情況，待雜交瘤細胞生長至大于孔底面積1/10時，可抽取培養上清，應用免疫細胞化學法進行抗體非特異性陽性篩選，對檢測陽性的雜交瘤細胞擴大培養，經檢測仍為陽性者予以凍存并分批有限稀釋法亞克隆。

1.2.1.4免疫沉淀-質譜法抗體特異性鑒定對陽性單克隆細胞，進行免疫沉淀-質譜法鑒定。用NP40細胞裂解液裂解白細胞，每107個細胞加入1 ml裂解液，冰上裂解1 h后，4℃，10 000 g，離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白質濃度，-20℃保存。將50 μl 50% Protein G-Agarose加入1～2 mg裂解的蛋白中，4℃混合30 min，100 g，4℃離心3 min，沉淀與Protein G非特異性結合的蛋白；收集上清至新的EP管中，加1～4 μg的抗體(200～300 μl細胞培養上清)，4℃混合2 h，再加50 μl Protein G，4℃混合2 h，4℃、100 g離心30 s，沉淀與細胞培養上清中的抗體結合的抗原蛋白；棄上清，PBS洗3次，加×5 SDS 上樣緩沖液，95℃加熱5 min，10 000離心3 min，每個泳道取20 μl進行SDS-PAGE，剩余樣品-80℃保存。在進行SDS-PAGE的同時，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，ECL顯色，進行Western blot分析，以確定抗體結合的抗原條帶，對SDS-PAGE分離得到的與抗體相互作用的蛋白切膠，進行質譜分析，通過確定抗原的性質鑒定抗體。

1.2.1.5Western blot篩選細胞株為驗證免疫沉淀-質譜法鑒定結果，在得知抗原性質后，進行Western blot抗體鑒定與細胞株篩選。將測得的抗原重組蛋白溶于上樣緩沖液，進行SDS-PAGE并轉PVDF膜，5%脫脂奶封閉，以細胞培養上清為一抗，培養基代替一抗作為陰性對照，室溫孵育1 h，TBS-T洗3次，加HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜3次后ECL顯色觀察結果。

1.2.1.6抗體效價測定采用間接酶聯免疫吸附法，以0.25 μg/ml的抗原重組蛋白包被96孔ELISA板，用3%BSA每孔300 μl進行封閉，以雜交瘤細胞培養上清或腹水作為一抗，設空白對照和陰性對照，37℃孵育1 h；洗滌后加二抗，37℃孵育1 h；洗滌后加入TMB底物顯色液及終止液，以450 nm測定OD值。

1.2.1.7單克隆抗體腹水制備與純化采用小鼠體內誘生腹水法制備單克隆抗體，將腹水300 g離心30 min除去細胞和其他沉淀物，飽和硫酸銨鹽析法初步純化后，應用AKTATMpure分離純化系統進行Protein G親和層析進一步純化。BCA蛋白測定試劑盒測定抗體蛋白含量，SDS-PAGE鑒定抗體純度。抗體效價檢測采用ELISA間接法，以陽性值與陰性值的比值大于 2.0 的最大抗體稀釋倍數確定抗體效價。

1.2.2單克隆抗體特性的鑒定

1.2.2.1單抗亞類鑒定應用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進行檢測。

1.2.2.2單抗親和力常數測定采用Beatty等[6]建立的方法測定單克隆抗體的親和力常數。分別用濃度為0.5 μg/ml、0.25 μg/ml的S100A9重組蛋白包被ELISA板；加入倍比稀釋的S100A9單克隆抗體，37℃溫育15 min；再加入羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗，37℃溫育30 min；TMB顯色10 min后測OD450nm值。以S100A9單克隆抗體濃度為橫坐標，以OD450nm值為縱坐標，繪出相應的2條反應曲線，以每條曲線上部平坦段的OD450nm值作為100%，在曲線上算出50%OD450nm值時對應的單克隆抗體的質量濃度，按照下面的公式計算：親和常數Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t為兩個不同的包被原濃度，[Ab]t、[Ab′]t為包被原濃度對應的抗體濃度。

1.2.2.3單克隆抗體特異性的鑒定[7]選用S100蛋白家族S100A8、S100A12和S100A13重組蛋白作為抑制劑，用阻斷ELISA法測定各抑制物的IC50，以抗體對S100A9蛋白的IC50與各抑制物的IC50之比的百分數為其交叉反應率，即交叉反應率(CR%)=IC50S100A9蛋白/IC50反應物×100%。

1.2.2.4單克隆抗體Western blot法檢測分析用勻漿器將人乳腺癌組織勻漿，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻組織，勻漿樣品，冰上孵育30 min后，3 150 g離心10 min，獲得組織蛋白。將其加入還原性 SDS-PAGE上樣緩沖液中，100℃沸水中變性10 min。分別以S100A9重組蛋白和乳腺癌組織蛋白進行SDS-PAGE并轉膜。加入ⅡD4B10雜交瘤制備腹水并純化的抗體作為一抗，PBS代替一抗作為陰性對照。室溫孵育后PBST 洗 3 次，加入HRP標記的山羊抗小鼠 IgG，ECL顯色后觀察結果。

1.2.2.5S100A9單克隆抗體在免疫組化檢測中的應用以本實驗室制備純化的S100A9單克隆抗體為一抗，對人乳腺正常組織和乳腺浸潤性導管癌組織石蠟切片進行免疫組化染色，參照Leica BOND Ⅲ說明書進行操作：上機前準備組織切片、配置相關試劑并對所放樣品進行編號；結束后取出組織進行顯色、襯染、封片：取出切片，加入DAB顯色液中顯色5 min，用流水沖洗10 min，蘇木素染液復染1 min，0.5%鹽酸酒精分化3 s，流水沖洗10 min，脫水、透明、封片，鏡下觀察。

2　結果

2.1免疫與融合效果免疫小鼠3只，免疫后小鼠血清用PBS稀釋200倍后進行倍比稀釋，同時設未免疫血清陰性對照和PBS空白對照，進行免疫細胞化學檢測，以出現明顯染色的最大稀釋倍數為抗體效價，結果3只小鼠加強免疫后血清抗體效價均達到1∶6 400。成功融合小鼠3只，每只4塊96孔板，融合率約90%。融合后12 d左右肉眼可見白色點狀克隆團，取細胞培養上清，進行免疫細胞化學檢測，設加強免疫后血清陽性對照和未免疫血清陰性對照，共檢測到35個陽性孔。

2.2免疫沉淀-質譜法抗體特異性鑒定對3號小鼠融合后的強陽性孔4F7進行3次有限稀釋法亞克隆后，為確定陽性單克隆細胞ⅡD4B10分泌抗體的性質，以白細胞裂解蛋白為抗原，以ⅡD4B10細胞培養上清為抗體，通過Protein G進行免疫沉淀，同時進行SDS-PAGE和Western blot，分析得到可以與雜交瘤細胞所產生的抗體相互作用的蛋白(圖1)。

將免疫沉淀獲得的抗原蛋白(圖1A箭頭所示)送上海中科新生命生物科技有限公司，進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectro-metry，MALDI-TOF-MS)，分析類型為一級肽指紋質量與二級肽碎片質量綜合分析(Combined MS+MS/MS)，檢索UniProt_human數據庫，鑒定為人S100A9蛋白。

2.3Western blot篩選S100A9單抗細胞株以重組人S100A9蛋白為抗原，進行SDS-PAGE電泳，以ⅡD4B10及其同一小鼠來源的單克隆雜交瘤細胞培養上清為一抗，以培養基代替一抗作為陰性對照，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，ECL顯色，進行Western blot，共得到11株分泌抗S100A9單抗的細胞(圖2)。

2.4腹水制備及效價檢測[8,9]以上細胞株經抗體效價檢測選取IID4B10進行小鼠腹水制備，3只小鼠10 d共收集12 ml腹水，間接ELISA 法檢測腹水效價為1∶3.18×105。

2.5單克隆抗體腹水純化利用飽和硫酸銨鹽析法和蛋白A親和層析柱純化后的腹水，通過SDS-PAGE檢測，可見雜質蛋白被大量去除，純化后的單克隆抗體純度達95%以上，回收率達80%。經SDS-PAGE證實，電泳形成2條大小分別約為50 kD和25 kD的IgG重鏈與輕鏈條帶(圖3)，分子量大小符合鼠源抗體特點。BCA法測腹水純化后蛋白質量濃度為1.086 mg/ml。

圖1　免疫沉淀獲取mAb結合的抗原Fig.1　Antigen was obtained by immunoprecipitationNote: A.SDS-PAGE(Coomassie blue staining)；B.Western blot.M.Marker;1.Leukocyte protein+Cell supernatant+Protein G；2.Cell supernatant+Protein G；3.Leukocyte protein+Protein G.

圖2　Western blot篩選S100A9單抗細胞株Fig.2　Monoclonal antibody cell strains against S100A9 screened by Western blot Note: M.Marker；A.SDS-PAGE(Coomassie blue staining); B-N.Western blot.

2.6單克隆抗體亞類鑒定以捕獲ELISA法測定抗S100A9單克隆抗體亞類，如表1所示，S100A9單克隆抗體重鏈為IgG1，輕鏈為kappa型(圖4)。

2.7親和力測定結果高親和力的抗體在短時間內可結合較多的抗原，且抗原-抗體復合物解離的半衰期也更長，在免疫學使用中效果也較好。2條反應曲線如圖5所示，ⅡD4B10所分泌的單克隆抗體與抗原結合達到飽和的50%所需單克隆抗體的濃度分別為0.746 μg/ml、0.479 μg/ml，代入親和力公式計算可得Ka為3.54×108L/mol。

圖3　SDS-PAGE 檢測純化前后抗體純度Fig.3　Identification of purity of antibody by SDS-PAGENote: M.Marker；1.No purified ascites；2.Ammonium sulfate purified antibody；3.Other protein；4.Affinity chromatography purified antibody.

表1S100A9單克隆抗體亞型鑒定

Tab.1Subtype identification of S100A9 mAb

1234567SubdassIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgMKappaLambdaOD450nm1.2920.0920.0910.0680.0660.5510.059

圖4　S100A9 mAb 抗體亞型Fig.4　Subtype of S100A9 mAb

圖5　S100A9 抗體親和常數測定曲線Fig.5　Curve for determination of affinity constant of S100A9 mAb

表2S100A9單抗與其他競爭物的交叉反應

Tab.2Percent cross-reactivity of S100A9 mAb with compete compounds

S100proteinfamily(recombinantprotein)IC50(ng/ml)Cross-reactivity(%)S100A99.89100%S100A8>2.0×103<0.12S100A12>1.0×104<0.03S100A13>1.0×104<0.03

圖6　Western blot檢測人乳腺癌組織中S100A9蛋白Fig.6　Western blot detection S100A9 in breast cancer tissue of human Note: A.Negative control PBS；B.Purified antibody.M.Marker；1.S100A9 recombinant protein；2.Human breast cancer tissue

2.8單克隆抗體特異性的測定測定S100A9單克隆抗體的特異性見表2，由表可以看出它與S100A8的交叉反應率小于0.12%，與其他競爭物的交叉反應率均小于0.03%，說明本試驗制備的抗S100A9單克隆抗體的特異性較強。

2.9Western blot法檢測分析利用純化好的S100A9小鼠腹水檢測其識別人乳腺癌組織中蛋白的情況。結果顯示(圖6)：在分子量為14 kD附近處出現特異性條帶，說明該抗體特異性識別人乳腺癌組織中的S100A9蛋白。

圖7　免疫組織化學檢測分析S100A9單抗染色人乳腺癌石蠟切片(×200)Fig.7　Detection of S100A9 protein expression in human breast cancer tissues(×200)Note: A.Negative control normal breast tissue；B.Breast cancer tissue.

2.10檢測人乳腺癌組織中S100A9蛋白表達乳腺癌組織中S100A9陽性染色主要定位于細胞的細胞質，呈棕黃色，定位清晰[10]。實驗結果如圖7：人正常乳腺組織中未見陽性表達，人乳腺癌組織中S100A9抗原表達呈陽性，自制的S100A9單抗對人乳腺癌組織中的S100A9蛋白具有識別能力。

3　討論

免疫原的選擇是抗體制備至關重要的一步，由于完整細胞通常具有強免疫原性，無需佐劑輔助[11]，能保持蛋白質的天然結構，故本研究以健康人外周血白細胞作為免疫原，制備抗天然蛋白的高特異性mAb。白細胞免疫小鼠后，豐富的蛋白被加工提呈，可產生大量的抗體，免疫后小鼠血清抗體效價檢測結果證實白細胞免疫小鼠取得了理想的免疫效果。根據克隆選擇原理，特異性免疫細胞可產生針對所有抗原的各種TCR、BCR和抗體[12]，在單克隆抗體篩選的過程中，每個克隆的特異性都會得到體現。因此，本研究首先通過免疫細胞化學法對雜交瘤細胞進行非特異性陽性篩選，然后再對單克隆細胞株進行抗體特異性鑒定。基于人們對抗原的認識比對抗體的認識更加完善、深入的現狀，本研究采取免疫沉淀技術獲取與雜交瘤細胞分泌的抗體結合的抗原，再通過質譜法鑒定抗原的性質，以此推斷抗體的性質，由此建立了一種全細胞免疫制備單抗的篩選鑒定方法。然而，免疫細胞化學法對表達量較少的膜表面抗原靈敏度欠佳，因此，對于針對細胞膜抗原的抗體篩選方法仍有待進一步實驗探索。

S100A9蛋白主要定位表達于中性粒細胞和單核細胞的胞質中，分別占胞內蛋白的45%和1%[3]，這使其容易作為優勢抗原參與免疫應答，在mAb的鑒定過程中首先被明確性質。S100A9蛋白分子量約14 kD[13]，在鑒定過程中，部分樣品在28 kD附近也出現了特異性結合條帶，這可能與S100A9蛋白常以同型二聚體形式存在相關[14]。為了得到純度較高的抗體，本研究先將腹水用飽和硫酸銨鹽析法沉淀，再用蛋白G親和層析法純化，此方法結合了硫酸銨鹽析法回收率較高和蛋白G親和層析法純化得到的抗體純度高的優點。間接ELISA法檢測抗體效價為1∶3.18×105，親和力常數為 3.54×108L/mol，依據Beatty[15]等的結論，親和常數為107～1012L/mol可視為高親和力抗體，說明該單抗與S100A9蛋白具有高結合力與親和力。該抗體可檢測人乳腺癌組織中S100A9蛋白的表達，這為該抗體在免疫組化中的應用提供了依據。

S100A9蛋白能夠參與炎癥反應，介導髓系細胞的遷移潛力，調節髓系細胞的成熟，富集髓源性抑制細胞促進腫瘤生長[4]。已有研究證實S100A9與許多疾病的相關性，例如S100A9在正常人血清含量為(338±202) ng/ml，在免疫性疾病或炎癥狀態下含量激增，并且在風濕性關節炎的關節腔液、慢性肺病患者病灶局部和痰液、炎性腸病的糞便、腎小球腎炎的腎組織中都可檢測到S100A9的高表達[16]。S100A9的定位也與癌癥中心的炎癥或其他病理過程相關，S100A9在乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、結直腸癌等許多癌癥類型上調[17]。目前多種在疾病的位點阻止S100A9和/或其活動的治療策略正在開發，例如炎癥、癌癥、心血管疾病、阿爾茨海默氏病等[18-20]。隨著對S100A9蛋白研究的深入，S100A9單抗的應用將會更加廣泛，本研究中S100A9抗原來自白細胞天然蛋白，這將使該抗體在未來的基礎研究和臨床應用中更具有優勢。

[1]吳玉林,顏天華.人體解剖生理學[M].南京：東南大學出版社,2012:88-89.

[2]Marenholz I,Lovering RC,Heizmann CW.An update of the S100 nomenclature[J].Biochim Biophys Acta,2006,1763(11):1282-1283.

[3]Hessian PA,Edgeworth J,Hogg N.MRP-8 and MRP-14,two abundant Ca2+-binding proteins of neutrophils and monocytes[J]. Leukoc Biol,1993,53(2):197-204.

[4]Markowitz J,Carson WE.Review of S100A9 biology and its role in cancer[J].Biochim Biophys Acta,2013,1835(1):100-109.

[5]單泓,王姣杰,別立莉,等.改良白膜法制備濃縮血小板及回收率的影響因素[J].中國組織工程研究,2014,18(7):1082-1087.

[6]杜雪梅,昌紅,孫煥英,等.鈣離子結合蛋白S100A9在乳腺癌中表達及臨床意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(6):637-639.

[7]王選年,周繼勇,楊艷艷,等.抗克倫特羅單克隆抗體雜交瘤的建立及其分泌單抗的免疫學特性鑒定[J].中國免疫學雜志,2004,20(3):194-198.

[8]顏秋霞,陳彩蓉,李介華,等.人睪丸特異性新基因hTSC29合成肽單克隆抗體制備與鑒定[J].中國免疫學雜志,2015,31(11):1505-1509.

[9]陶嶸,倪振華,陽圣,等.抗PSMA膜外域單克隆抗體的制備及初步應用[J].中國免疫學雜志,2016,32(2):205-209.

[10]尹磊淼,張慶華,王宇,等.鈣結合蛋白S100A9功能的研究進展[J].復旦學報(醫學版),2011,38(5):445-448.

[11](美)Howard等著.抗體制備與使用實驗指南[M].張權庚等譯.北京：科學出版社,2010:14.

[12]何維.醫學免疫學[M].北京：人民衛生出版社,2010:16-17.

[13]Odink K,Cerletti N,Bruggen J,etal.Two calcium-binding proteins in infiltrate macrophages of rheumatoid arthritis[J].Nature,1987,330(6143):80-82.

[14]Nacken W,Roth J,Sorg C,etal.S100A9/S100A8:Myeloid representatives of the S100 protein family as prominent players in innate immunity[J]. Microsc Res Tech,2003,60(6):569-580.

[15]Beatty JD,Beatty BG,Vlanos WG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay[J].J Immunological Methods,1987,100(1/2):173-179.

[16]郭佳，王要軍，劉海軍，等.S100A9在腫瘤方面的研究進展[J].現代生物醫學進展，2009，(22)：4379-4380，4386.

[17]Srikrishna G.S100A8 and S100A9:New insights into their roles in malignancy[J].Innate Immun,2012,4(1):31-40.

[18]Yui S,Nakatani Y,Mikami M.Calprotectin (S100A8/S100A9),an inflammatory protein complex from neutrophils with a broad apoptosis-inducing activity[J]. Biol Pharm Bull,2003,26(6):753-760.

[19]Averill MM,Kerkhoff C,Bornfeldt KE.S100A8 and S100A9 in cardiovascular biology and disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(2):223-229.

[20]Chang KA,Kim HJ,Suh YH.The role of S100A9 in the pathogenesis of alzheimer′s disease:the therapeutic effects of S100A9 knockdown or knockout[J]. Neurodegener Dis,2012,10(1-4):27-29.

[收稿2016-03-08修回2016-04-17]

(編輯許四平)

Development and identification of mouse anti-human S100A9 natural protein

MI Dan-Yang，DUAN Rui，SONG Jun-Ying，SUN Xiang-Dong，ZHANG Zhong-Yun，YAN Min，YUAN Yong，ZHANG Zhen-Qiang，ZHANG Gai-Ping，LIU Wen-Di.

Traditional Chinese Medicine Immunology Laboratory,Henan University of Traditional Chinese Medicine/Zhengzhou Key Laboratory of Antibodomics，Zhengzhou 450046,China

Objective:To prepare and identify the mouse anti-human monoclonal antibodies (mAbs) using leukocytes as immunogens. Methods: The mice were immunized using human peripheral blood leukocytes.Then,use of B lymphocyte hybridoma technology preparation of mAbs,followed screening by immunocytochemistry and limited dilution.The secreted mAbs were identified by immunoprecipitation,mass spectrometry,Western blot,ELISA and immunohistochemistry.Results: The 35 positive polyclonal cells were obtained,of which 11 strains secreted mAbs against S100A9.And one strain was used to prepare monoclonal antibody.The purified mAb against S100A9 were purified and identified as IgG1 subtype,with the titer,purity and affinity constant was 1∶3.18×105,95% and 3.54×108L/mol,respectively.This mAb generally had 0.12 % crossed reactivity to S100A8 ,and showed little or no cross reactivity to S100A12 and S100A13.The prepared monoclonal antibodies can specifically recognizes the S100A9 antigen in human breast cancer tissues．Conclusion: Successful preparation of mAb against S100A9,which can secrete specific mAb against S100A9 protein with high titers and specificity have been established successfully，which laid the foundation for the immunology application.

Leukocyte；S100A9；Monoclonal antibody；Immunity characterisation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.017

米丹陽(1987年-)，女，碩士，助理實驗師，主要從事醫學免疫學研究，E-mail:amymidanyang@163.com。

及指導教師：劉文第(1954年-)，男，教授，主要從事抗體組學研究，E-mail:wendiliu@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)10-1485-06

①本文為2015年度河南省科技創新人才計劃(No.154100510019)河南中醫學院創新團隊(No.2014XCXTD01)和河南中醫學院基本科研業務專項課題(No.2014KYYWF-ZZCX3-06)。

②河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，河南450002。