環(huán)磷酰胺免疫抑制機制及在動物模型上的應用①

鐘金鳳　方熱軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長沙410128)

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環(huán)磷酰胺免疫抑制機制及在動物模型上的應用①

鐘金鳳方熱軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長沙410128)

近年來，環(huán)境污染、生態(tài)失衡等引發(fā)的人與動物免疫抑制性疾病逐年上升。為進一步研究此類疾病，免疫抑制模型的建立顯得尤為重要。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)是制備動物免疫抑制模型中應用廣泛的藥物，它最早可追溯到第一次世界大戰(zhàn)，耶魯大學Louis Goodman和Alfred Gilman教授解剖戰(zhàn)死于生化武器的士兵時發(fā)現(xiàn)芥子氣有殺死淋巴組織的效果，由此揭開免疫抑制劑的序幕。1935年人工合成毒性較低但作用與芥子氣相似的氮芥(Nitrogen mustard)，試驗證明其對淋巴肉瘤和白血病有療效，但副作用大；隨后以氮芥為基礎(chǔ)，合成眾多的免疫抑制劑，其中CTX能通過殺傷免疫細胞而影響免疫的各階段而得以廣泛的應用[1]。

1　CTX在體內(nèi)的吸收、代謝

CTX易溶于水和酒精，在體內(nèi)易于吸收，生物利用率為85%～100%，小部分藥品在肝臟和腸道出現(xiàn)首過效應[2]。無論是經(jīng)口服還是靜脈注射的CTX在體內(nèi)主要由肝臟進行代謝，在肝細胞色素P450酶的作用下，CTX首先發(fā)生4位C羥化，生成初級代謝產(chǎn)物4-羥基環(huán)磷酰胺，4-羥基環(huán)磷酰胺易通過被動擴散進入細胞[3]，并產(chǎn)生同分異構(gòu)體——醛磷酰胺，兩種混合物入血后與血漿蛋白結(jié)合而快速分布全身，毒性低。極少部分4-羥基環(huán)磷酰胺和醛磷酰胺可氧化生成4-酮環(huán)磷酰胺和羧基磷酰胺，無細胞毒作用，絕大部分隨尿排出體外；大部分未經(jīng)氧化的醛磷酰胺可部分降解為活性代謝產(chǎn)物磷酰胺氮芥和丙烯醛，羧基磷酰胺轉(zhuǎn)化為去甲氮芥[4](圖1)。

磷酰胺氮芥通過共價結(jié)合于DNA上，引起DNA-DNA、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)和雙鏈DNA斷裂，破壞快速生長的細胞[5]。丙烯醛將DNA中鳥嘌呤N-7烷基化生成兩種產(chǎn)物：一種產(chǎn)物是烷基化產(chǎn)生乙基和羥乙基兩種取代基的胺，另一種產(chǎn)物是產(chǎn)生兩個乙基交聯(lián)胺，它們分別是：N-2-乙基-N7-鳥嘌呤-N-2-羥乙基胺{N-[2-(N7-guaninyl) ethyl]-N-[2-hydroxyethyl]-amine，G-NOR-OH}單加成物和N,N-2-二乙基-N7-鳥嘌呤交聯(lián){N,N-bis[2-(N7-guaninyl) ethyl] amine cross-links，G-NOR-G}，G-NOR-G交聯(lián)具有強烈的細胞毒性，是CTX生物活性的主要成分[6]。去甲氮芥可引起組蛋白H2A的變異體H2A.X和P53的磷酸化，引起DNA受損[7]。

2　CTX免疫抑制機制

2.1CTX對細胞周期的影響機制

2.1.1ATM/ATR-Chk1/Chk2(人共濟失調(diào)毛細血管擴張性突變基因/人共濟失調(diào)毛細血管擴張性突變基因Rad3相關(guān)蛋白-細胞周期監(jiān)控點激酶1/細胞周期監(jiān)控點激酶2)路徑調(diào)節(jié)機制連續(xù)分裂的細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束的全過程稱為一個細胞周期，包含G1、S、G2和M期，并通過一套嚴格有效的細胞周期監(jiān)測點來保證遺傳物質(zhì)的正確復制[8]。CTX代謝活性物G-NOR-G交聯(lián)影響維持基因組穩(wěn)定的重要因子來改變細胞周期(圖2)。G-NOR-G交聯(lián)導致DNA受損后，ATM/ATR-Chk1/Chk2被激活，致p53的Ser15、20、37磷酸化，活化的p53從而使細胞周期停滯于S期[9,10]。

圖1　CTX在體內(nèi)代謝過程[3，4]Fig.1　Metabolic processes of CTX in body[3，4]

2.1.2Cyclin D1/CDK4(細胞周期蛋白D1/細胞周期蛋白依賴性激酶4)路徑調(diào)節(jié)機制真核細胞的分裂周期由調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)家族調(diào)節(jié)，CDK4和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)結(jié)合形成的配合物是一個重要控制細胞增殖過程中的G1期的元件[11]。Cyclin D1是細胞周期蛋白亞型之一，能夠促進細胞周期由G1期轉(zhuǎn)向S期。3周齡BALB/c雄性小鼠連續(xù)7 d腹腔注射80 mg/(kg·d) CTX用以誘導骨髓細胞抑制，采用免疫印跡法分析Cyclin D1/CDK4蛋白表達，結(jié)果顯示試驗組Cyclin D1/CDK4蛋白表達顯著低于空白對照組[12]，導致細胞停滯于G1期。

2.2CTX對細胞凋亡的影響機制

2.2.1Fas/Fas L(脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配體)系統(tǒng)介導的細胞凋亡CTX可影響死亡受體信號轉(zhuǎn)導通路Fas/Fas L介導的細胞凋亡(圖3)[13]。脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)as)是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與脂肪酸合成酶配體(Fas ligand，F(xiàn)as L)結(jié)合后，再募集Fas相關(guān)死亡閾蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD蛋白)，構(gòu)成死亡誘導信號復合體，由此激活下游蛋白caspases(含半胱氨酸的天門冬氨酸蛋白水解酶，cysteinyl aspartate specific proteinase)產(chǎn)生，引起細胞凋亡不可逆進行[14]。大鼠胸腺細胞暴露于70 mg/kg CTX 4～48 h，免疫組織化學測定

圖2　CTX通過ATM/ATR-Chk1/Chk2信號通路調(diào)節(jié)機制[8]Fig.2　Regulation mechanism of CTX through ATM/ATR-Chk1/Chk2 signaling pathway[8]Note: ATM.Ataxia telangiectasia mutated；ATR.Atm-rad 3-related；Chk1.Checkpoint kinase 1；Chk2.Checkpoint kinase 2；p53.p53 gene；P.Phosphorylation.

結(jié)果顯示：在4～8 h內(nèi)試驗組Fas抗原蛋白表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05)[15]。人淋巴瘤Jurkat細胞系單獨或用含有2 mg/kg CTX培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，用流式細胞術(shù)檢測出試驗組細胞表面含有Fas抗原蛋白，對照組則無Fas抗原蛋白，結(jié)果表明，CTX可能是通過Fas途徑介導細胞凋亡[16]。除此，CTX能顯著誘導Caspases蛋白產(chǎn)生(P<0.05)[17]。

2.2.2Bax/Bcl-2(B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X蛋白/B淋巴細胞瘤-2)介導的細胞凋亡細胞脂肪變性與氧應激使Bcl-2相關(guān)X蛋白(bcl-2 assaciated x protein，Bax)合成增多且轉(zhuǎn)移至線粒體外膜形成同源二聚體，引起線粒體PT孔打開，釋放細胞色素C，誘發(fā)細胞凋亡；而分布于線粒體外膜的Bcl-2可與Bax結(jié)合，避免Bax同源二聚體形成，抑制PT孔開放，體現(xiàn)抗凋亡作用。CTX能顯著增加成年雄性Wistar大鼠心臟組織Bax mRNA表達水平(P<0.05)，而降低抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(P<0.05)[18]。單劑量150 mg/kg CTX作用活體小鼠，第二天紅細胞生成受到影響，凋亡增大，細胞密度減少，骨髓龕受嚴重干擾，檢測顯示Bax mRNA表達明顯[19]。由此可見，CTX可增加促凋亡基因同時抑制抗凋亡基因mRNA表達，從而達到誘導細胞凋亡的目的。

2.3CTX對細胞因子的影響機制CTX對細胞因子的影響主要通過(樹突狀細胞相關(guān)C-型凝集素-1 Dectin-1，dendritic cell-associated c-type lectin-1)、Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)和Toll樣受體4，(Toll-like receptor 4，TLR4)信號通路實現(xiàn)。Dectin-1主要表達在單核巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、肥大細胞、成纖維細胞、嗜酸性粒細胞等細胞上，與細胞成熟、免疫狀態(tài)有關(guān)，它與TLR2和TLR4最終通過NF-κB途徑影響細胞因子分泌(圖4)[20，21]。CTX可抑制小鼠肺部Dectin-1 mRNA表達，使得對真菌敏感[22]。24只雌性昆明小鼠腹腔注射CTX150 mg/kg制備免疫抑制模型，4 h后肺泡巨噬細胞TLR2 mRNA表達與對照組相比極顯著下降；8 h后TLR4 mRNA表達顯著降低[23]。BALB/c小鼠于第1、4天腹腔注射150 mg/kg CTX建立免疫抑制模型，第9天取脾臟測定相關(guān)mRNA，研究發(fā)現(xiàn)：模型組小鼠Th2細胞因子IL-4、GATA-3mRNA(表達于Th2細胞的鋅指狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子)相對表達顯著高于對照組，而Th1細胞因子IL-2、T-bet mRNA與對照組無顯著差異，結(jié)果表明：CTX可調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子[24，25]。

圖3　CTX通過Fas/Fas L系統(tǒng)介導細胞凋亡機制[13]Fig.3　Mechanism of CTX-mediated apoptos by Fas/Fas L system[13]Note: Fas.Fatty acid synthase；Fas L.Fas ligand；FADD.Fas-associated death domain protein；caspases.Cysteinyl aspartate specific proteinase.

2.4CTX對細胞過氧化的影響機制CTX對脂質(zhì)過氧化的影響主要通過超氧化歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSHpx)等關(guān)鍵酶而起作用。在線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中，極少部分單電子從呼吸鏈中漏出，直接傳遞給O2生成氧自由基，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如丙二醛 (Malonaldehyde,MDA)等，引發(fā)細胞氧化損傷，正常生理狀態(tài)時，自由基不斷產(chǎn)生，通過SOD和GSHpx不斷清除，但在用藥或病理狀態(tài)下，此平衡有所改變(圖5)[26]。Tripathi等[27]以100 mg/kg腹膜注射小鼠表明CTX能降低SOD和GSH含量，增加MDA含量；將CTX按30、90、150、300和450 mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給藥于昆明雌性小鼠，4 h后，GSH活性顯著降低(P<0.05)[28]。CTX可引起氧化應激，以SOD和GSH含量減少為表現(xiàn)[29]，較多的自由基潴留于體內(nèi)，引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化，DNA損傷等。

圖4　CTX通過dectin-1、TLR2和TLR4信號調(diào)節(jié)細胞因子相關(guān)機制Fig.4　Mechanism of CTX regulating cell factors through Dectin-1,TLR2 and TLR4 signaling pathwayNote: Dectin-1.Dendritic cell-associated c-type lectin-1；TLR2.Toll-like receptor 2；TLR4.Toll-like receptor 4；NF-κB.Nuclear factor-Kappa B.

3　CTX在動物抑制模型上的運用

CTX作為免疫抑制劑被廣泛運用在動物，主要集中在豬、雞和小鼠上，而羊、牛、馬等動物未見報道，且多選擇無特定病原體(SPF)或清潔級動物，通過肌肉注射或者腹腔注射，建立免疫抑制模型。CTX施藥劑量差異甚大，最大的單次劑量為200 mg/kg、總劑量為500 mg/kg，最小的單次劑量為4 mg/kg、總劑量為10 mg/kg，從總體趨勢看，在單次劑量為200 mg/kg、總劑量為500 mg/kg的范疇內(nèi)，隨著劑量越大，CTX作用緯度越廣，持續(xù)時間越長(表1)。

3.1CTX對模型動物免疫器官的影響一定劑量的CTX可顯著抑制動物的外周免疫器官。馮焱等[42]研究表明用80、120 mg/kg CTX作用的AA雞法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著(P<0.01)低于對照組；朱曉彤等[43]也表明80 mg/kg CTX可顯著降低雞群的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)，160 mg/kg可顯著降低雞群的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)。連續(xù)注射3 d給3周齡雞注射4 mg/(kg·d)CTX，法氏囊指數(shù)極顯著低于對照組(P<0.01)[38]。究其原因，可能是CTX顯著提高脾臟、法氏囊和胸腺細胞凋亡率(P<0.05)[30]。

圖5　CTX對脂質(zhì)過氧化影響機制[26]Fig.5　Mechanism of CTX on lipid peroxidation[26]Note: SOD.Superoxide dismutase；GSHpx.Glutathione peroxidase；GSH.Glutathione；GSSG.Oxidized glutathione；GSR.Glutathione reductase.

表1CTX在動物抑制模型上運用

Tab.1Literatures of CTX about animal models

LiteraturesExperimentalanimalsDrugdeliveryDrugdoseChenetal[30]one-day-older-huang-chickensintramuscularinjection40mg/kg,everyfourthdayfor3timesFickenetal[31]7-to-8-week-oldfemaleNicholasturkeysintramuscularinjection0-100mg/kg,onceadayfor3successivedaysMedleauetal[32]dogsintramuscularinjection10mg/kg,asingledoseMiao[33]mouseintraperitonealinjection80mg/kg,onceadayfor3successivedaysHaradaetal[34]pigsintraperitonealinjection15mg/kg,fiveinjectionsHuyanetal[35]specified-pathogen-freemaleBalb/cmouseintramuscularinjection50-200mg/kg,twoinjectiononday1andday4Fanetal[36]1-day-oldWhiteRomanchickens(male)intramuscularinjection80mg/kg,onceadayfor3successivedaysFanetal[37]1-day-oldWhiteRomanchickens(male)intramuscularinjection80mg/kg,onceadayfor3successivedaysElabasyetal[38]3-week-oldinbredchickensintramuscularinjection4mg/(kg·d),onceadayfor3successivedaysDerbyshireetal[39]5-week-oldspecified-pathogen-freepigletsintraperitonealinjection100mg/kg,asingledoseNakamuraetal[40]4-week-oldspecified-pathogen-freechickensintraperitonealinjection50mg/kg,onceadayfor3successivedaysHanetal[41]weanedpigsintraperitonealinjection50mg/kg,asingledose

一定劑量的CTX對肝臟也有影響。雄性ICR小鼠腹腔注射100、150、200 mg/(kg·d) CTX，連續(xù)5，7 d后試驗組肝組織SOD和GSH含量有所下降，MDA含量顯著升高，肝臟線粒體膜電位則隨CTX劑量增大呈下降趨勢，另外，低劑量CP有抑制小鼠肝臟線粒體電壓依賴性陰離子通道蛋白(VDAC)轉(zhuǎn)錄的趨勢。由此表明，CP對肝臟的損傷作用主要是改變線粒體VDAC的表達量從而降低線粒體細胞脂質(zhì)氧化能力[44]。

3.2CTX對模型動物免疫細胞的影響CTX對動物非特異性淋巴細胞的影響非常廣泛。用0～100 mg/kg CTX對7～8周尼古拉斯雌性火雞作用3日，血液學參數(shù)顯示白細胞、淋巴細胞、血小板和異嗜性細胞顯著減少[31]。Medleau等[32]等用10 mg/kg CTX肌肉注射健康狗，3 d后外周血白細胞顯著降低(P<0.05)。給昆明種小鼠連續(xù)注射3 d 80 mg/kg CTX，7 d后小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率極顯著降低[33]。8頭3～4月齡約克豬于0、2、4、6、8 d腹腔注射15 mg/kg CTX，總白細胞和淋巴細胞在2～12 d顯著低于對照組，中性粒細胞在4～10 d顯著低于對照組[34]，這可能與成髓細胞有絲分裂活動受抑制和淋巴細胞尤其是B淋巴細胞有絲分裂靜止有關(guān)[45]。

CTX對動物特異性免疫細胞影響顯著。Huyan等[35]給無特定病原體的雄性BALB/c小鼠于第1天和第4天肌肉注射50、75、100、125、150、175、200 mg/kg CTX，結(jié)果表明：除 50 mg/kg組，其余組白細胞在第1天呈現(xiàn)劑量依賴型減少，在第4天達到最低，第10天反彈，第17天再度回落； 100～150 mg/kg在第4天呈現(xiàn)出CD3+T、CD4+T顯著減少，CD8+T顯著增加，在第10天CD19+T顯著減少。經(jīng)CTX處理禽的免疫器官的滑囊中T細胞分布未觀察到顯著改變，但B淋巴細胞顯著減少，甚至消失[46]。

3.3CTX對模型動物免疫分子的影響CTX對非特異性免疫分子的影響是廣泛而顯著的。Fan等[36]用80 mg/kg劑量對11日齡白羅曼公仔雞連續(xù)肌注3次，第7天和第28天血清IL-12顯著低于對照組，IL-6在第7、14、21天顯著低于對照組。Fan等[37]用CTX對11日齡白羅曼公仔雞以80 mg/kg劑量連續(xù)3 d肌注，結(jié)果顯示：模型組血清IgG、IgM、IFN-γ、IL-6在第7、14、21和28天顯著低于對照組。給昆明種小鼠腹腔注射CTX 50 mg/kg，隔日1次，共3次，結(jié)果表明：模型組IL-2極顯著低于對照組(P<0.01)，IL-4顯著低于對照組(P<0.05)[26]。

CTX可抑制抗體分子生成。于肌肉注射方式連續(xù)3 d給3周齡雞注射4 mg/(kg·d) CTX，在28 d和35 d靜脈注射0.1 ml混合抗原(包含綿羊紅細胞 SRBC 5×108和熱滅活牛布魯氏菌 BA 1×109)，42 d和49 d SRBC抗體滴度顯著低于對照組，42 d BA抗體滴度顯著低于對照組(P<0.05)[38]。Han等[41]也證明CTX可降低實驗組牛血清白蛋白抗體滴度。這可能是CTX降低脾臟抗體形成細胞的數(shù)量[43]。

3.4CTX對模型動物抗病性能的影響CTX在一定程度上可增加動物對疾病的易感性。Griffith等[47]試驗表明以20 mg/kg CTX隔天肌肉注射可增加由豬霍亂沙門氏菌孔城道夫變種引起試驗豬的死亡。3周齡SPF雞用CTX處理后再感染禽腺病毒血清型8(TR630和Saga97)呈現(xiàn)心包積液和死亡，而未用CTX處理組，既沒有抗體陽性也沒有組織病變[48]。4周齡SPF白來航雞連續(xù)3 d腹腔注射50 mg CTX，再用5×105cfu高毒株(TK 736系)大腸桿菌處理，死亡率為90%，未用CTX處理組死亡率為10%；用1×109cfu低毒株(64-28-Y1-A系)作用時，CTX處理組的死亡率為30%，未處理組為0%[40]。以上試驗顯示：當CTX與其他病原微生物同時進入機體，可加劇微生物對機體的病理作用。

綜上，CTX對免疫性能產(chǎn)生較為廣泛而全面的影響，一定劑量的CTX可顯著抑制動物的外周免疫器官如脾臟、法氏囊等，抑制動物非特異性和特異性淋巴細胞，降低細胞因子和抗體產(chǎn)生；增加動物對疾病的易感性；同時對動物生長有一定抑制作用。

4　小結(jié)

CTX在體內(nèi)代謝物磷酰胺氮芥、丙烯醛和去甲氮芥三種主要的活性產(chǎn)物，通過ATM/ATR-Chk1/Chk2和Cyclin D1/CDK4信號通路對細胞周期調(diào)節(jié)，使細胞周期停滯于S和G1期；通過Fas/Fas L和Bax/Bcl-2兩條途徑介導細胞凋亡，誘導凋亡不可逆發(fā)生；經(jīng)由Dectin-1、TLR2和TLR4信號通路實現(xiàn)對細胞因子的調(diào)節(jié)，改變體內(nèi)Th1/Th2平衡；并影響脂質(zhì)過氧化路徑關(guān)鍵酶如SOD、GSH調(diào)節(jié)細胞過氧化，引起細胞損傷。雖然對CTX免疫抑制的機制已有大量研究，但仍存在諸多問題，尤其是調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚，如CTX如何啟動死亡受體信號轉(zhuǎn)導通路Fas/Fas L的；CTX是否通過除TLR2和TLR4外的其他TLR樣受體調(diào)節(jié)細胞因子等；需要進一步探究。除此，就CTX建立免疫抑制動物模型時，其施藥劑量、施藥方式、作用時間等差異甚大，對動物的免疫抑制程度及時效也不盡相同；為此，建議建立用CTX制備免疫抑制模型試驗標準，為免疫調(diào)節(jié)劑的研究提供更為科學合理的免疫抑制靶動物模型。

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[收稿2015-11-28修回2015-12-21]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.029

①本文受國家自然科學基金項目(31572419)和衡陽市科技局項目(2011KN52)資助。

鐘金鳳(1980年-)，女，在讀博士，副教授，主要從事營養(yǎng)與免疫學的研究，同時就職于湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院，衡陽421005。

及指導教師：方熱軍(1963年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事生理學研究，E-mail：fangrj63@126.com。

R392.33

A

1000-484X(2016)10-1541-06