托樣受體3(TLR-3)信號通路介導的病毒免疫逃逸①

江一帆　汪銘書　程安春

(四川農業大學禽病防治研究中心，成都611130)

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托樣受體3(TLR-3)信號通路介導的病毒免疫逃逸①

江一帆汪銘書程安春

(四川農業大學禽病防治研究中心，成都611130)

天然免疫是機體抵御病毒入侵的首道防線，對病原快速有效地識別是激發天然免疫的前提。動物的天然免疫依賴一類能夠識別微生物特定組分的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)。其中，托樣受體3(Toll like receptor-3，TLR3)通過識別病毒感染時產生的dsRNA，啟動下游的信號轉導，上調Ⅰ型干擾素α和β(Interferon α/β，IFNα/β)的表達，Ⅰ型干擾素能夠誘導細胞產生抗病毒蛋白(Antivirus protein，AVP)，同時也有助于激發機體的適應性免疫[1]。

TLR3信號通路屬于非髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)依賴的信號通路。當TLR3識別病毒的dsRNA后，形成同質二聚體[2]，并通過自身的TIR結構域(Toll/Interleukin-1 receptor domain，TIR)募集其獨有的接頭分子β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)[3]。 TRIF與腫瘤壞死因子受體相關因子3(TNF receptor associated factors，TRAF3)結合,促使干擾素調節因子3和7(Interferon regulatory factor，IRF)被TANK 結合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)和核轉錄抑制酶IKKε(Inhibitor of nuclear factor kappa-Bε)磷酸化[4]，磷酸化后的IRF3和IRF7進入細胞核上調IFNα/β基因的轉錄表達[5]。

生物進化的長期選擇使病毒進化出了相應的干擾機制，來逃避宿主的天然免疫防御。研究發現病毒可以通過干擾TLR3信號通路來逃避宿主天然免疫的殺傷。

1　干擾TLR3對dsRNA的識別

病毒在宿主細胞內復制的過程中，伴隨著核酸中間產物和副產物的聚集[6]，位于核內體的TLR3能識別胞質內病毒的dsRNA，激活天然免疫信號通路，誘導機體產生抗病毒反應。某些病毒通過干擾TLR3對于病毒dsRNA的識別，抑制Ⅰ型干擾素的表達，減弱宿主的抗病毒作用。

1.1形成復制復合體隱蔽dsRNA許多RNA病毒進入細胞后通過改造宿主質膜產生膜囊泡形成復制復合體[7]，使病毒的dsRNA不被宿主細胞內的TLR3識別，提高病毒在宿主細胞中成功復制的機率。

研究發現，重癥急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome-coronaviridae，SARS-CoV)利用它的NSP4蛋白改造宿主細胞質膜結構，誘導形成一連串的雙層膜囊泡(Double-membrane vesicles DMVs)，將病毒dsRNA與細胞質隔離開來[8]，阻斷TLR3的識別，抑制 Ⅰ型干擾素的表達[9]。中東呼吸綜合征病毒(Middle east respiratory syndrome-coronaviridae，MERS-CoV)上存在相似的機制[10]。黃病毒屬的登革熱病毒(Dengue virus，DENV)和乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)具有類似DMVs的病毒粒質樣結構(Viroplasm-like structures，VLS)[11,12]，他們在病毒干擾TLR3識別自身核酸成分的過程中，發揮著相似的作用。

1.2病毒因子與dsRNA相互作用TLR3對dsRNA的識別依賴dsRNA的可識別區域與受體氨基酸結合位點之間的正確結合[2]。當dsRNA的結合位點受到病毒影響，TLR3與dsRNA的結合將受到阻斷，無法引發下游的信號轉導。黃病毒科病毒編碼的VP35蛋白具有一個折疊的C端RNA結合域(RNA binding domain，RBD)[13,14]，這個結合域能夠和dsRNA發生高親和度的非序列相關性結合[15]，阻斷了TLR3的識別，下調IFNα/β的表達量，該結構域也被稱作干擾素抑制域(IFN-inhibitory domain，IID)[16]。SARS-CoV的N蛋白也具有相似結構[17，18]。

2　影響信號通路上游的TRIF接頭分子

TRIF有三個功能結構域，N端的死亡結構域(N-Terminal domain，NTD)、中段的TIR結構域和處于C端的受體作用蛋白1綁定序列[Receptor interacting protein 1(RIP1)binding motif][19]。TRIF和 TLR3各自的TIR結構域相互結合[20]，激活下一步的信號轉導。

2.1切割TLRs的接頭分子病毒感染的過程中，TLR3信號通路中的接頭分子TRIF會受到某些病毒編碼蛋白切割，抑制宿主的Ⅰ型干擾素表達。丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)、腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)、甲肝病毒(Hepatitis A virus，HAV)都有相似的機制[21-25]。

HAV-3C蛋白的前體蛋白3CD能夠切割TRIF，這個過程依賴3Cpro的蛋白酶活性和3D蛋白對3C蛋白的特異性修飾。而HAV-3C蛋白的另一個前體蛋白3ABC蛋白，同樣利用3C蛋白酶活性和3A蛋白的錨定作用裂解視黃酸誘導基因蛋白Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)信號通路中的接頭分子MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS/IPS-1/VISA/Cardif)[25]。這也為我們揭示了一種有趣的現象，病毒利用同一種蛋白酶切割多種接頭分子來干擾多條信號通路。

2.2與TLRs信號通路上相關調控因子競爭性結合自然界中一些病原微生物編碼的蛋白中也存在類似TIR的結構域，這些蛋白會與TLR3接頭分子的TIR結構域發生競爭性結合，影響受體和接頭分子的正確結合，從而阻斷TLR3信號通路的信號轉導。這種現象多見于細菌[26]，但在病毒上，這種機制還比較罕見。

目前，在牛痘病毒編碼的AR46蛋白上發現TIR結構域[27]，它能夠和其他含有TIR結構域的蛋白分子形成復合物。早前有研究表明AR46蛋白在宿主中具有結合Myd88和TRIF接頭分子的能力，通過競爭性結合，阻礙TRIF與TLRs-TIR的結合，阻礙下游信號轉導[27]。但新的研究表明，AR46的關鍵衍生肽段VIPER只結合接頭分子Mal和TRAM，而非Myd88和TRIF[28]。AR46蛋白TIR結構域究竟存在怎樣的作用機制還難有定論，值得更進一步的研究。

3　影響通路下游核轉錄因子IRF3/7功能

3.1抑制IKKi磷酸化作用病毒感染后干擾素調控因子IRF3/7將進入細胞核啟動干擾素轉錄表達，IRF3/7產生相應的生物學活性需要經過核轉錄抑制酶IKKα/ε(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α/ε)的磷酸化才能實現。針對IRF3/7的功能特性，病毒也進化出了相應的免疫逃逸機制抑制關鍵核轉錄因子入核作用，阻斷Ⅰ型干擾素的轉錄和表達。

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)編碼的NS2B/3蛋白能與IKKε相互作用，通過遮蔽IKKε的激酶活性區，使之喪失相應的酶活性，無法作用IRF3，阻斷了IRF3的入核[29]。埃博拉病毒(Ebola virus，EBoV)的VP35蛋白通過直接結合IKKε，從而影響IRF3的磷酸化[30]。甲型流感病毒(Influenza A virus)編碼的NS1蛋白能夠在胞質內和核內與IKKα發生相互作用，最終阻斷IRF7的入核[31]。這類蛋白下調Ⅰ型干擾素的表達量，是病毒減弱宿主天然免疫的重要手段。

3.2借助宿主泛素化系統降解核轉錄因子動物體內的泛素化系統通過分類識別靶蛋白分子，對靶蛋白進行特異性修飾，活化或者降解機體內的蛋白組分。病原微生物雖然不具備完整的泛素化系統，卻能利用宿主的泛素化系統降解天然免疫信號轉導的關鍵蛋白。

3.2.1產生E3泛素連接酶及其相似蛋白病原微生物能夠編碼產生泛素連接酶或其類似物，直接調控宿主的泛素化系統。研究發現多種細菌能夠編碼與宿主相似的E3泛素連接酶[32]，一些病毒編碼的蛋白和E3泛素連接酶相似性很低但能夠發揮與之相同的生物學功能。卡波希氏瘤皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)立即早期基因編碼的具有核轉錄特性的RTA蛋白(the RTA immediate-early nuclear transcription factor)與E3泛素連接酶具有相近的生物學功能[33]，能夠促使IRF7進入蛋白酶體被降解。

KSHV感染的細胞中，發現IRF7的含量和蛋白酶體之間存在相關性，加入蛋白酶體抑制劑MG142能夠增加IRF7的含量[34]。進一步的研究證實了KSHV-RTA在引導IRF7發生多聚泛素化的過程中，發揮了 E3泛素連接酶的作用，經過多聚泛素化修飾的IRF7最終被26S蛋白酶體所降解[35]。

3.2.2作用核轉錄因子誘導其泛素化降解研究發現，部分病毒不直接參與宿主的泛素化系統，而是編碼一類具有標記功能的蛋白與目標蛋白發生相互作用，使宿主的泛素化系統把目標蛋白識別為需要降解的組分，最終通過蛋白酶體將其降解。這種免疫逃逸機制在多種病毒中被發現，輪狀病毒(Rotavirus，RV)編碼的NSP1蛋白[36]和瘟病毒屬的病毒(Pestivirus)編碼的Npro蛋白[37]都能夠和宿主TLRs信號通路中的IRF3發生結合，從而誘導它被宿主的泛素化系統降解，逃避宿主的天然免疫。近來的研究還發現獲得性免疫缺失綜合征(HIV)編碼的蛋白對于IRF3也具有相似的作用[38]。

研究HIV-1激活TLR3信號通路時發現，TLR3信號通路中重要的核轉錄因子IRF3體內的含量出現明顯下降，而它的下調獨立于病毒在細胞中的復制，這種現象被認為與HIV-1兩個重要的輔助蛋白Vif、Vpr有關，類似Vif和Vpr蛋白誘導APOBEC3G蛋白的降解[39,40]。進一步的研究表明，這兩種蛋白不直接降解IRF3，而是由宿主的泛素化系統通過蛋白酶體降解IRF3。研究人員還確定了IRF3的N端兩個賴氨酸殘基(K87、K105)是Vif和Vpr誘導的IRF3降解的重要靶點[41]，Vif和Vpr蛋白很可能通過作用于這幾個賴氨酸殘基，從而引發宿主泛素化系統識別并最終將IRF3蛋白降解的。HIV-1的這種免疫逃逸機制在病毒感染細胞后的復制初期至關重要。

圖1　TLR3信號通路介導的免疫逃逸Fig.1　Evasion mechanisms of virus mediated by TLR-3 signaling pathwayNote: A.SARS-CoV-N protein block the beginning PRRs-RNA-recognition step of IFN-b induction by its RNA-binding activity；B.Positive-strand RNA [(+)RNA] viruses induce membrane rearrangements that create membrane-linked RNA replication compartments to Avoid being recognition by TLR3；C.EV71 and HAV disrupts TLR3 signaling by targeting TRIF for cleavage by 3C and 3CD；D.DENV-NS2B/3 interacts with IKKi,inhibiting phosphorylation of IRF3 relying on IKKi,and stop the signaling transduction；E.The ubiquitin-associated proteosome degradation of IRF3 was associated with HIV-Vif- and Vpr-mediated ubiquitination through HIV-Vif and-Vpr binding with IRF3.

4　展望

TLR3信號通路是誘導Ⅰ型干擾素產生的重要途徑，研究證實了病毒能夠不同程度地干擾 TLR3的識別功能，病毒能夠不同程度地干擾ILR3信號轉導的各個環節，從而逃避宿主的天然免疫的殺傷(如圖1)。大量研究結果顯示病毒綜合了多種手段共同抑制TLR3信號通路：一種病毒能夠產生多種蛋白作用同一個信號轉導的不同元件，也能夠通過編碼不同蛋白同時抑制多個信號轉導過程，甚至某些病毒編碼的一種蛋白能夠作用多條信號通路，這些特性使得病毒能夠更加有效的感染細胞并成功復制。天然免疫中處于上游的接頭分子和下游的核轉錄因子種類有限，被各條信號通路所共用，當病毒抑制這些元件時，信號的轉導難以通過替代途徑得到修正，這使接頭分子和核轉錄因子成為病毒最有效的攻擊靶點，這方面的研究對于我們了解病毒逃逸天然免疫防御的機制有很大意義。近年來針對TLRs與病毒相互作用方面的研究已經取得了很多成果，但是仍然存在很多尚待確認的問題，因此進一步闡明TLR3介導的免疫逃逸機制，將為疾病的預防和控制提供新的理論和方法，也能為預防病毒感染的研究開辟新的領域。

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[收稿2015-09-25修回2015-12-01]

(編輯倪鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.032

①本文為國家現代農業(水禽)產業技術體系專項(CARS-43-8)、國家科技支撐計劃項目(2015BAD12B05)和國家自然科學基金(3147223)。

江一帆(1991年-)，男，在讀碩士，主要從事水禽免疫學方面的研究。

及指導教師：程安春(1965年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事水禽傳染病的基礎和應用研究，E-mail：chenganchun@vip.163.com。

S855

A

1000-484X(2016)10-1554-04