PJ34對A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓 柯，郝吉慶

PJ34對A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓 柯，郝吉慶

目的 探討PJ34對肺腺癌順鉑耐藥（A549/DDP）細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因的影響。方法 將A549/DDP細(xì)胞分為對照組、順鉑單藥組、PJ34單藥組、PJ34聯(lián)合順鉑組，RTPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)肺耐藥蛋白（LRP）、多藥耐藥蛋白（MRP）、P-糖蛋白（P-gp）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（TOPO-Ⅱα）mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 除了TOPO-Ⅱα外，其余四種耐藥相關(guān)基因mRNA在A549/DDP細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于A549細(xì)胞（P＜0.05）。經(jīng)PJ34處理后的A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP、P-gp mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降（P＜0.05），且呈濃度及時(shí)間依賴性。結(jié)論 LRP、MRP、P-gp、GST-π可能參與了A549/DDP細(xì)胞對順鉑的繼發(fā)耐藥，PJ34可能通過下調(diào)MRP、P-gp mRNA轉(zhuǎn)錄水平而間接增加順鉑對DNA的損傷。

肺腺癌；PARP-1抑制劑；順鉑；耐藥性；多藥耐藥基因

中晚期肺癌患者無法行根治性切除術(shù)，以鉑類為主的聯(lián)合化療成為主要治療手段，僅有25%患者生存達(dá)到5年［1］，多藥耐藥的產(chǎn)生是治療失敗的主要原因。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1［Poly（ADP-ribose）merase-1，PARP-1］是存在于多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白核酶，其維持基因組穩(wěn)定，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［2］。課題組前期研究［3］表明，PARP-1在肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株中表達(dá)明顯上調(diào)，第三代PARP-1抑制劑PJ34可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制DNA損傷修復(fù)、增強(qiáng)肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。研究［4-5］顯示肺耐藥蛋白（LRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、P-糖蛋白（P-gp）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOPOⅡ）在腫瘤的耐藥中發(fā)揮重要作用。該研究探討耐藥相關(guān)基因在肺腺癌順鉑耐藥株與野生株間的表達(dá)差異及PJ34對其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞（A549/DDP）株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；A549細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)，均培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞長至80%～90%傳代。A549/DDP細(xì)胞初始加入含500 ng/ml DDP的藥物培養(yǎng)液，兩代后加入終濃度為2 000 ng/ ml的順鉑維持其耐藥表型。

1.2 試劑及器材 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；PJ34購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；順鉑注射液購自山東齊魯制藥有限公司；RNA提取TRIzol、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Select Maser Mix均購自美國Thermo公司；PCR基因擴(kuò)增儀MJ Research PTC-100購自美國BIO-RAD公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀StepOne Plus購自美國Applied Biosystem公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 A549/DDP細(xì)胞分為對照組、PJ34單藥組、PJ34聯(lián)合順鉑組，PJ34組分為0、3、6、12、24 mg/L 5個(gè)濃度梯度，分別處理24 h，另取濃度為3 mg/L的PJ34分別處理24、48、72 h；PJ34聯(lián)合順鉑組給予3 mg/L PJ34+11 mg/L順鉑處理24 h，A549細(xì)胞作為對照組。每個(gè)處理組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 RNA提取和定量測定 步驟包括：①取處理完畢后各組細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，6孔板每孔內(nèi)加入1 ml TRIzol消化，然后移入無RNA酶的EP管中，室溫孵育5 min；②1 ml TRIzol中加入0.2 ml氯仿，劇烈晃動(dòng)15 s，室溫孵育2～3 min；③4℃、12 000 r/ min離心15min，溶液分為無色上清水相、中間層（膜狀蛋白）、下層紅色苯酚氯仿層；④吸取上層無色水相至另一無RNA酶的EP管中，加入500 μl異丙醇，4℃、12 000 r/min離心10 min（RNA，附著于管底）；⑤移除上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液，簡單振蕩，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液；⑥空氣干燥5～10 min，加入20～50 μl ddH2O重懸RNA；⑦55～60℃水浴10～15 min；⑧測RNA濃度及純度；⑨直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，總RNA量為1.5 μg，總反應(yīng)體積20 μl，反應(yīng)條件；25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或儲(chǔ)存于-20℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 GAPDH、LRP、MRP、P-gp、GST-

π、TOPO-Ⅱα引物由上海生工生物公司合成，GAPDH作為內(nèi)參，其基因序列見表1。QRT-PCR反應(yīng)體系20 μl，包括SYBR Select Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50℃保溫2 min，95℃預(yù)熱2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCT法分析基因的相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，上述數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。圖表在GraphPad Prism 5.0中生成。

2 結(jié)果

2.1 A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線見圖1。

2.2 A549與A549/DDP細(xì)胞間耐藥相關(guān)基因表達(dá) A549/DDP及A549細(xì)胞內(nèi)LRP、MRP、P-gp、GST-π、TOPO-Ⅱα均有表達(dá)，但LRP、MRP、P-gp、GST-π在A549/DDP細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=69.282，P＜0.01；t=110.177，P＜0.01；t=323.916，P＜0.01；t =258.287，P＜0.01），TOPO-Ⅱα在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.117，P＞0.05），見圖2。

2.3 PJ34對A549/DDP細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1 PCR擴(kuò)增曲線

2.3.1 PJ34對A549/DDP細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的量效關(guān)系 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，加入不同濃度（0、3、6、12、24 mg/L）PJ34處理24 h后，A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 756.279，P＜0.05），P-gp表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 865.031，P＜0.05），且二者呈明顯的濃度依賴性，而LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ表達(dá)量隨PJ34濃度的增加未見明顯變化，見圖3。

圖2 A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因表達(dá)的差異

圖3 PJ34對A549/DDP細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的量效關(guān)系

2.3.2 PJ34對A549/DDP細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，加入3 mg/L的PJ34分別處理24、48、72 h后，A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP表達(dá)量隨給藥時(shí)間的延長逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 119.237，P＜0.05），P-gp表達(dá)量隨給藥時(shí)間的延長逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 639.624，P＜0.05），呈明顯的時(shí)間依賴性，而LRP、GST-π、TOPO-Ⅱα表達(dá)量隨時(shí)間延長未見明顯變化，見圖4。

圖4 PJ34對A549/DDP細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

2.3.3 PJ34聯(lián)合順鉑后A549/DDP細(xì)胞內(nèi)MRP、P-gp mRNA水平的變化 取對數(shù)生長期的A549/ DDP細(xì)胞，分為對照組、順鉑（11 mg/L）單藥組、PJ34（3 mg/L）單藥組及PJ34（3 mg/L）聯(lián)合順鉑（11 mg/L）組，結(jié)果顯示：PJ34單藥組較對照組MRP mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=83.563，P＜0.05），P-gp mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=79.315，P＜0.05）；PJ34聯(lián)合順鉑組較順鉑單藥組MRP mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 74.253，P＜0.05），P-gp mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=69.969，P＜0.05），PJ34單藥組較PJ34聯(lián)合順鉑組MRP、P-gp mRNA水平未見明顯變化。見圖5。

3 討論

LRP是人類穹窿體的重要組成部分，其參與阿霉素、長春新堿、順鉑等多種藥物的耐藥。研究［6］顯示LRP高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者較低表達(dá)患者對順鉑的敏感性降低。MRP是一種ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在肺癌的繼發(fā)耐藥中起重要作用，參與非小細(xì)胞肺癌對順鉑的繼發(fā)耐藥［7］。P-gp是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的主要成員之一，其可作為肺腺癌對順鉑產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)預(yù)測因子［8］。GST-π屬于Ⅱ相代謝酶，與多種腫瘤的化療耐藥密切相關(guān)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株GST-π mRNA水平高于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌比非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對順鉑更敏感，對順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者中GST-π的表達(dá)明顯增高［9］。TOPO-Ⅱ是催化DNA結(jié)果的基本核酶，細(xì)胞內(nèi)TOPO-ⅡmRNA水平及活性與以其為靶點(diǎn)的相關(guān)藥物的耐藥密切相關(guān)，TOPO-Ⅱ的表達(dá)增加可增加肺癌細(xì)胞對表柔比星的敏感性，TOPO-Ⅱ表達(dá)下降，肺癌細(xì)胞對VP-16的敏感降低。本實(shí)驗(yàn)研究顯示LRP、MRP、P-gp、GST-π mRNA在A549/DDP細(xì)胞內(nèi)的水平明顯高于A549細(xì)胞，提示LRP、MRP、P-gp、GST-π在肺腺癌對順鉑的繼發(fā)耐藥中發(fā)揮重要作用，這與上述研究結(jié)果一致，而TOPO-ⅡαmRNA在兩種細(xì)胞內(nèi)未見明顯差異，與肺腺癌對順鉑的繼發(fā)耐藥無關(guān)，這可能因?yàn)轫樸K為非TOPO-Ⅱ靶點(diǎn)藥物。

PARP-1是PARP家族中含量最多、功能最重要的亞型。目前，國內(nèi)外將PARP-1作為疾病治療的新靶點(diǎn)，已研制出多種PARP-1抑制劑，并顯示出良好的治療效果。PARP-1抑制劑增強(qiáng)ERCC1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌對順鉑的敏感性，在順鉑耐藥的睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中也顯示出來良好的治療效果［10-11］。PJ34是新一代選擇性PARP-1抑制劑，較傳統(tǒng)PARP抑制劑，無論口服還是注射都顯示出較高的生物利用度。研究［12］顯示在急性創(chuàng)傷性腦損傷，PJ34維持血腦屏障的完整性，減輕腦組織水腫及炎癥反應(yīng)。PJ34還可通過降低FANCD2、BRCA2和RAD51蛋白和mRNA表達(dá)水平，下調(diào)FA/BRCA通路活性增加對骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用，部分逆轉(zhuǎn)對美法蘭的耐藥［13］。本研究結(jié)果顯示，PJ34可降低多藥耐藥相關(guān)基因MRP、P-gp的表達(dá)水平，并且具有濃度及時(shí)間依賴性。PJ34聯(lián)合順鉑組與單藥順鉑組比較表現(xiàn)出協(xié)同降低MRP、P-gp的表達(dá)水平，差異有顯著性，而與單藥PJ34比較未見明顯差異，推測其可能原因?yàn)轫樸K作為細(xì)胞周期非依賴性化療藥物其主要作用機(jī)制為直接誘導(dǎo)細(xì)胞DNA的損傷，對細(xì)胞內(nèi)MRP、P-gp的表達(dá)無影響。

綜上所述，本研究提示A549細(xì)胞順鉑繼發(fā)耐藥與LRP、MRP、P-gp、GST-π過表達(dá)相關(guān)，PJ34可通過下調(diào)MRP、P-gp mRNA的水平，部分逆轉(zhuǎn)A549/ DDP對順鉑的耐藥。這為PJ34在鉑類耐藥非小細(xì)胞肺癌患者的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

［1］ Torre L A，Bray F，Siegel R L，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］ Rajesh M，Mukhopadhyay P，Godlewski G，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase inhibition decreases angiogenesis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，350（4）：1056-62.

［3］ 姚圓圓，郝吉慶.PJ34對肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖及耐藥性的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（6）：865-70.

［4］ Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines［J］.Oncol Rep，2011，26（5）：1081-9.

［5］ 喻龍姍，張開光.胃癌多藥耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（4）：449-52.

［6］ Zurita A J，Diestra J E，Condom E，et al.Lung resistance-related protein as a predictor of clinical outcome in advanced testicular germ-cell tumours［J］.Br J Cancer，2003，88（6）：879-86.

［7］ Ikuta K，Takemura K，Sasaki K，et al.Expression of multidrug resistance proteins and accumulation of cisplatin in human nonsmall cell lung cancer cells［J］.Biol Pharm Bull，2005，28（4）：707-12.

［8］ Inoue Y，Gika M，Abiko T，et al.Bcl-2 overexpression enhances in vitro sensitivity against docetaxel in non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep，2005，13（2）：259-64.

［9］ Hirano T，Kato H，Maeda M，et al.Identification of postoperative adjuvant chemotherapy responders in non-small cell lung cancer by novel biomarker［J］.Int J Cancer，2005，117（3）：460-8.

［10］Cheng H，Zhang Z，Borczuk A，et al.PARP inhibition selectively increase sentivity to cisplatin in ERCC1-low non-small cell lung cancer［J］.Carcioenesis，2013，34（4）：739-49.

［11］Cavallo F，Graziani G，Antinozzi C，et al.Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to Cisplatin and poly（adp-ribose）polymerase inhibition［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51563.

［12］Tao X，Chen X，Hao S，et al.Protective actions of PJ34，a poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor，on the blood-brain barrier after traumatic brain injury in mice［J］.Neuroscience，2015，291：26-36.

［13］Xiong T，Wei H，Chen X，et al.PJ34，a poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）inhibitor，reverses melphalan-resistance and inhibits repair of DNA double-strand breaks by targeting the FA/ BRCA pathway in multidrug resistant multiple myeloma cell line RPMI8226/R［J］.Int J Oncol，2015，46（1）：223-32.

Effect of PJ34 on the expression
of multidrug resistance related gene in A549/DDP cells

Han Ke，Hao Jiqing
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the impact of PJ34 on human pulmonary carcinoma cell line A549/DDP-related multiple drug resistance genes.Methods A549/DDP cells were divided into 3 groups：negative control，DDP-treated group，PJ34-treated group，PJ34 and DDP-treated group.The mRNA transcription levels of LRP，MRP，P-gp，GST-π，TOPO-Ⅱα were quantified in each group by RT-PCR.Results The mRNA transcription levels of LRP，MRP，P-gp，GST-π in A549/DDP cells were significantly higher than those in the A549 cells（P＜0.05）. The mRNA transcription levels of MRP，P-gp in A549/DDP cells dramatically decreased in a time and dose-dependent manner after PJ34 treatment（P＜0.05）.Conclusion LRP，MRP，P-gp，GST-π are probably involved in secondary drug resistance of DDP in A549/DDP cells.PJ34 sensitizes DNA to DDP damage by indirectly downregulating mRNA levels of MRP and P-gp.

pulmonary adenocarcinoma；PARP-1 inhibitors；cisplatin；tolerance；multidrug resistance gene

R 734.2

A

1000-1492（2016）08-1128-05

時(shí)間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.024.html

2016-04-19 接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH142）；安徽省對外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（編號：1503062023）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 230022作者簡介：韓 柯，男，碩士研究生；

郝吉慶，女，博士，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayfy_hjq@163.com111