8種血液病患者人巨細胞病毒感染情況分析

徐 爽，呂曉麗，鄒菊賢，楊文青，李銳成，沈建軍，張惠中

(第四軍醫大學唐都醫院臨床實驗與檢驗科，西安 710038)

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·臨床研究·

8種血液病患者人巨細胞病毒感染情況分析

徐 爽，呂曉麗，鄒菊賢，楊文青，李銳成，沈建軍，張惠中△

(第四軍醫大學唐都醫院臨床實驗與檢驗科，西安 710038)

目的 探討不同血液病患者人巨細胞病毒(HCMV)感染情況。方法 選取該院8種血液病患者共274例，采用實時熒光定量PCR法對患者血液或尿液進行HCMV DNA檢測。結果 血液病患者感染率由高到低依次為急性淋巴細胞白血病(ALL，39.47%)、急性混合型白血病(AL，28.57%)、急性非淋巴細胞白血病(ANLL，26.15%)、再生障礙性貧血(AA，20.34%)、骨髓異常增生綜合征(MDS，14.29%)、慢性粒細胞白血病(CML，13.64%)、三系血細胞減少(0.40%)，19例非霍奇金淋巴瘤(NHL)未檢出HCMV感染。274例患者總陽性率達13.87%，其中AL陽性率最高(23.02%)。腫瘤患者HCMV感染率高于非腫瘤患者，感染率分別為24.85%和13.76%，差異有統計學意義(χ2=4.339，P<0.05)。8種血液病患者HCMV DNA載量均值為 5.00×103IU/mL，最高達1.29×106IU/mL。結論 8種血液病患者存在不同程度的HCMV感染，且腫瘤患者較非腫瘤患者感染率更高。

血液病； 人巨細胞病毒； 實時熒光定量PCR

人巨細胞病毒(HCMV)屬β皰疹病毒亞科，屬廣泛傳播的機會致病病毒，在人群中血漿免疫球蛋白G(IgG)抗體陽性率為40%～100%[1]。免疫功能正常者初次感染后無癥狀，大部分病毒被免疫系統清除，少部分呈潛伏狀態，但當抵抗力下降，潛伏病毒被重新激活，引起活動性感染甚至致死性損傷，其中血液系統是其感染的主要受累部位之一[2-3]。HCMV干擾造血功能，使造血細胞增殖和分化，導致間質性肺炎病死率高達80%以上[4-5]。近年來，分子生物學技術的發展為病毒感染診斷開辟了新途徑，其中實時熒光定量PCR法因其靈敏、特異、光譜技術敏感及精確定量的特點得到廣泛應用。該技術全程全封閉反應，從根本上解決PCR擴增產物污染問題，具有較高的靈敏度、特異度、精確性，高效率、污染小等特點，為臨床及科研提供及時、準確、可靠的實驗室數據[6]。現應用實時熒光定量PCR法檢測8種血液病患者HCMV DNA，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年12月該院住院血液系統疾病患者274例，其中急性混合型白血病(AL)21例，慢性粒細胞白血病(CML)22例，急性淋巴細胞白血病(ALL)38例，急性非淋巴細胞白血病(ANLL)65例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)19例，三系血細胞減少36例，骨髓異常增生綜合征(MDS)14例，再生障礙性貧血(AA)59例。

1.2 儀器與試劑 儀器為美國ABI-7500型實時熒光定量PCR擴增儀，人巨細胞病毒核酸檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司生產。

1.3 方法 (1)血液標本：抽取患者血液3 mL，4 000 r/min離心5 min，吸取血清100 μL置于0.5 mL無菌Eppendorf管內，加入等量DNA提取液振蕩混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min離心5 min，上清液備用。(2)尿液標本：囑患者用無菌生理鹽水或潔凈清水沖洗外陰部后留取初尿液(晨尿)于無菌尿杯中。(3)非血性尿標本：將尿液倒入無菌干燥管，14 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加無菌生理鹽水，振蕩混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀。(4)血性尿標本：將尿液倒入無菌干燥管，14 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加無菌去離子水振蕩混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀，重復洗滌直至上清液清亮(去除紅細胞)后留沉淀。向沉淀中加50 μL DNA提取液振蕩混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min離心5 min，上清液備用。

1.4 基因擴增與結果判讀 分別吸取樣品DNA、質控品DNA和陽性定量參考品各2 μL于擴增管中，8 000 r/min離心1 min后上機擴增，每次擴增均設陽性、陰性對照和空白對照。擴增參數為93 ℃預變性120 s；93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s,10個循環；93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s,30個循環，55 ℃時采集熒光。根據陽性定量參考品擴增結果分析并調節基線和閾值，線性相關系數(r)>0.98。若增長曲線不呈S型或CT值等于30，則判定檢測結果為陰性，若增長曲線呈S型且CT值小于30，結果為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數和百分比表示，組間比較使用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 8種不同血液病患者HCMV DNA檢測結果比較 274例患者HCMV感染56例，感染率20.44%。其中ALL患者感染率最高(39.47%)，其次為AL和ANLL(28.57%和26.15%)。274例患者共檢測1 233例次，總陽性率達13.87%，其中AL、ALL、ANLL占陽性總例數的比例較高，分別為23.02%、17.80%、14.40%。

2.2 腫瘤患者和非腫瘤患者陽性率結果比較 CML、ALL、ANLL、AL、NHL共165例，HCMV感染41例，感染率24.85%；非腫瘤性血液病患者感染率為13.76%，差異有統計學意義(χ2=4.962，P<0.05)。見表1。

2.3 5種血液病患者HCMV DNA載量分析 同一疾病患者之間病毒載量差異較大，最高可達1.29×106IU/mL，5種血液病患者HCMV DNA載量不同，但均值為5.00×103IU/mL。見表2。

表1 腫瘤患者和非腫瘤患者陽性率結果比較

表2 5種血液病患者的HCMV DNA載量分析

3 討 論

HCMV屬于皰疹病毒科，是特異性DNA病毒，自首次分離后被證實是一種在人群中廣泛存在的感染因子[7]。因HCMV在體內可感染T細胞、B細胞、NK細胞及單核細胞，進一步造成免疫抑制，因此免疫功能低下者較健康者更易感染。隨著現代生物醫學的發展，造血干細胞移植取得長足進步，尤其是在血液惡性疾病的危險分期和分層治療中得到廣泛應用，較大改善疾病預后，但移植后細胞免疫和體液免疫功能下降，致使患者易發生病毒(單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、EB病毒、巨細胞病毒)感染，其中HCMV感染發生率較高[8]。目前，國內外對HCMV致病的研究多集中于新生兒及器官移植患者，實際上多數血液病同樣會對機體免疫系統造成損害，導致機體免疫功能下降，從而誘發HCMV 再次活化[9]。

本研究結果顯示，274例患者HCMV感染者56例，感染率20.44%，其中ALL患者感染率最高，達39.47%，其次為AL，占28.57%，可能與HCMV在體內易感染T細胞、B細胞及單核細胞，造成免疫抑制有關。本組AA患者HCMV感染率達21.53%，在8種疾病的陽性總例數中占20.34%。桂敏等[10]研究表明，HCMV活動性感染可使造血干細胞明顯減少，引起造血衰竭，但因骨髓HCMV活動性感染導致部分再生障礙性白血病的發生，還是骨髓 HCMV活動性感染加重再生障礙性白血病，有待于進一步研究。本組274例患者共檢測1 233例次，總陽性率達13.87%，其中ANLL所占比例最高，其次為AA和ALL，這一結果除了與HCMV易感免疫細胞造成免疫抑制有關，還可能與疾病的狀態和監測時間間隔有關，提示合理的病毒檢測策略對感染的控制至關重要。

Tabata等[11]研究表明，HCMV感染能刺激腫瘤細胞TGF-β1的產生和激活，逃避宿主的免疫應答，且在HCMV感染的不同組織中發現HCMV增加內皮細胞中整合蛋白αvβ6 的表達，從而進一步激活TGF-β1分泌，抑制宿主的免疫應答，促進腫瘤的發生和發展。本研究結果說明，腫瘤患者HCMV感染率(24.85%)高于非腫瘤患者(13.76%)，差異有統計學意義(χ2=4.962，P<0.05)，提示除與上述機制有關外，腫瘤患者免疫狀態低于非腫瘤患者，因而更易誘發HCMV感染及其他機會病原體感染。此外，免疫功能低下者白血病發病率明顯升高，一旦發病可使機體免疫功能進一步受損，減弱免疫系統對腫瘤細胞的免疫監視和抗感染能力，致使病毒活化和激活，進一步加重病情。

本研究結果顯示，同一疾病患者之間病毒載量差異較大，最高數值可達1.29×106IU/mL，5種血液病患者HCMV DNA的載量不同，但均值多集中在5.00×103IU/mL。目前尚無明確定義合適的病毒載量判斷感染的輕重。國外研究顯示大于5.00×103IU/mL 具有較高的患HCMV風險[12]。國內也有研究顯示HCMV DNA大于5.00×103IU/mL時病情轉歸均較差[13]。所以，及時監測并準確定量血液病患者HCMV DNA載量，可幫助臨床及早治療，縮短治療時間，并為評估治療方案的成功與否和耐藥性的出現提供重要依據。

綜上所述，不同血液病患者存在不同程度HCMV感染，且腫瘤患者較非腫瘤患者感染率更高，實時定量PCR法檢測HCMV DNA具有快速、高靈敏度和特異度，有重要的臨床應用價值。

[1]Zhang X,Huang YP,Gao HN,et al.Quantification of cytomegalovirus glycoprotein Bn DNA in hematopoietic stem cell transplant recipients by real-time PCR[J].PLoS One,2012,7(12):e51224.

[2]浮苗，田可港，鄭曉群．人巨細胞病毒潛伏感染相關基因研究進展[J]．中國病原生物學雜志，2014，9(12)：1134-1138．

[3]何政賢，潘思年，陳健良，等．人巨細胞病毒對造血系統的影響[J]．中華兒科雜志，2003，41(5)：321-324．

[4]Ichihara H,Nakamae H,Hirose A,et al.Immunoglobulin prophylaxis against cytomegalovirus infection in patients at high risk of infection following allogeneic hematopoietic cell transplantation[J].Transplant Proc,2011,43(10):3927-3932.

[5]劉川，鄒葉青，石慶芝．造血干細胞移植中人巨細胞病毒檢測：熒光定量聚合酶鏈反應的早期診斷價值[J]．中國組織工程研究，2014，18(28)：4563-4567．

[6]阮強，何蓉．人巨細胞病毒感染的實驗室檢測與診斷[J]．實用兒科臨床雜志，2012，27(10)：729-731．

[7]Muoz-Cobo B,Solano C,Costa E,et al.Dynamics of cytomegalovirus (CMV) plasma DNAemia in initial and recurrent episodes of active CMV infection in the allogeneic stem cell transplantation setting:implications for designing preemptive antiviral therapy strategies[J].Biol Blood Marrow Transplant,2011,17(11):1602-1611.

[8]金欣，陳建魁，于農，等．熒光定量聚合酶鏈反應監測造血干細胞移植后巨細胞病毒感染[J]．中國衛生檢驗雜志，2010，20(6)：1431-1432．

[9]Capria S,Gentile G,Capobianchi A,et al.Prospective cytomegalovirus monitoring during first-line chemotherapy in patients with acute myeloid leukemia[J].J Med Virol,2010,82(7):1201-1207.

[10]桂敏，周東風，孟浦，等．再生障礙性貧血患兒骨髓內人巨細胞病毒活動性感染對造血功能的影響[J]．實用兒科臨床雜志，2008，23(22)：1763-1764．

[11]Tabata T,Kawakatsu H,Maidji E,et al.Induction of an epithelial integrin alphavbeta 6 in human cytomegalovirus-infected endothelial cells leads to activation of transforming growth factor-beta1 and increased collagen production[J].Am J Pathol,2008,172(4):1127-1140.

[12]Hadaya K,Wunderli W,Deffernez C,et al.Monitoring of cytomegalovirus infection in solid-organ transplant recipients by an ultrasensitive plasma PCR assay[J].J Clin Microbiol,2003,41(8):3757-3764.

[13]趙曉濤，張正，張彥榮，等．熒光定量聚合酶鏈反應檢測移植受者的巨細胞病毒DNA載量[J]．中華檢驗醫學雜志，2006，29(5)：438-440．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.049

A

1673-4130(2016)20-2915-03

2016-02-16

2016-04-18)

△通訊作者，E-mail：zhz328@ffmmu.edu.cn。