實時熒光定量聚合酶鏈反應聯合檢測6種性病病原微生物的研究

王曉東,王 然,李鳳煥,向 鑫

(中國人民解放軍第二五四醫院檢驗科，天津 300142)

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·臨床研究·

實時熒光定量聚合酶鏈反應聯合檢測6種性病病原微生物的研究

王曉東,王 然,李鳳煥,向 鑫

(中國人民解放軍第二五四醫院檢驗科，天津 300142)

目的 探討實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)同時檢測多種性病病原體的可行性和臨床意義。方法 采用FQ-PCR方法對716例患者生殖道標本的淋球菌(NGH)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、梅毒螺旋體(TP)、人乳頭瘤病毒(HPV)6/11型及16/18型等6種微生物或亞型進行定量檢測，并與定性聚合酶鏈反應(PCR)進行比較。結果 2種PCR方法對6種病原體檢測的總符合率分別為94.83%、96.16%、95.29%、100%、94.37%、94.12%。陽性率差異分別為1.29%、1.45%、2.18%、0、7.04%、0.98%， HPV6/11-DNA FQ-PCR法陽性率高于PCR(P<0.01),其他5項指標檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。 陽性標本定量平均拷貝數對數分別為(6.71±3.36)、(5.56±2.48)、 (6.83±3.17)、 (4.89±3.52)、(5.75±3.13)、(4.95±2.68)。結論 FQ-PCR操作簡便、快速，高效，并能準確定量,對性病的診斷、發展和預后監測、療效評價、指導用藥具有重要的臨床意義。

聚合酶鏈式反應，熒光定量； 奈瑟氏球菌，淋病； 衣原體，沙眼； 支原體，解脲； 梅毒螺旋體； 乳頭瘤病毒

實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)檢測通常擴增不同目的DNA片段，設計不同的特異引物及溫度參數，在同一擴增參數條件下，同時檢測多種病原微生物[1]。有關調查顯示，性傳播疾病發病率在我國正逐年上升[2]，人群結構以中青年為主，與受教育的文化程度呈負相關，為性傳播疾病得到及時、有效的治療，以及加強流行病防控，因此選擇快速、敏感、特異、高效的檢測手段非常重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料 716例標本來自2010年5月至2015年5月該院泌尿外科、婦科、皮膚性病門診的泌尿生殖系統感染及有高危性接觸史患者，男332例，年齡16～59歲，平均32歲；女353例，年齡15～51歲，平均27歲。

1.2 儀器與試劑 DA-7600 基因擴增儀及熒光定量PCR試劑，分別購自達安基因和華美生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板制備 女性宮頸及陰道分泌物拭子或男性尿道拭子的無菌試管中，加入1.5 mL生理鹽水并旋渦混勻器,充分震蕩，將混懸液倒入無菌EP管，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀加50 μL DNA提取液，混勻后置金屬熱浴,100 ℃ 10 min，10 000 r/min離心5 min，分別取5 μL模板DNA置入相對應的6種目的DNA熒光定量擴增管。

1.3.2 FQ-PCR擴增參數 包含引物、熒光探針、底物dNTP、Taq聚合酶、離子buffer和模板的反應體系50 μL，94 ℃預變性120 s，然后 94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,35個循環，72 ℃ 延伸過程讀取熒光，擴增結束導入標準曲線，定量超過100 copy/mL為陽性。

1.3.3 PCR擴增參數 包含引物、底物dNTP、Taq聚合酶、離子buffer的40 μL PCR擴增體系內加入5 μL模板DNA，預變性98 ℃ 180 s，加入2 U Taq酶，94 ℃ 30 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,35個循環，72 ℃ 5 min。取擴增產物10 μL進行1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠做指示劑，5～6 V/cm電泳2 h,凝膠置254 nm波長紫外透照儀下參照,Maker 比對熒光條帶位置。

2 結 果

2.1 FQ-PCR檢測結果 716例標本申請6、5、4、3、2、1項性病病原體DNA檢測，分別為43、62、207、365、369、286例。見表1。

表1 FQ-PCR檢測6種性病病原體DNA結果

表2 FQ-PCR與PCR檢測結果的比較[n/n(%)]

2.2 2種檢測方法的結果比較 性病病原體DNA檢出率依次為解脲支原體(UU)、6/11型人乳頭瘤病毒(HPV)、淋球菌(NGH)、沙眼衣原體(CT)、HPV16/18型、梅毒螺旋體(TP)，與有關報道接近[3-6]。陽性率和定量拷貝值最高為UU，54例標本定量超過108copy/μL，陽性定量水平最低為CT，平均低于104copy/μL，最高上限未超過106copy/μL。在進行熒光定量檢測的同時，從DNA模板分別隨機抽取對應78、69、92、56、71、51份DNA模板，分別進行NGH、CT、UU、TP、HPV6/11、HPV16/18 PCR擴增，總符合率94.83%，陽性率差異1.29%；CT-DNA 總符合率96.16%，陽性率差異1.45%； UU-DNA總符合率95.29%，陽性率差異2.18%；TP-DNA 總符合率100%；HPV6/11-DNA 總符合率95.77%，陽性率差異4.22%；HPV16/18-DNA 總符合率94.12%，陽性率差異0.98%。 2種方法檢測HPV6/11-DNA陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01),其他比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

性傳播疾病的病原微生物種類較多，常見的細菌感染主要是NGH，可引起泌尿生殖系統的急性炎性或化膿性感染[7]。本研究結果表明，感染率最高的病原微生物是UU，支原體無細胞壁，不能維持固定的形態而呈現多形性，不易細胞培養。感染泌尿生殖道的衣原體主要種類是CT，它是嚴格的活細胞內寄生的微生物，具有獨特的發育周期。UU和CT引起的泌尿生殖道感染癥狀類似，是主要的非淋菌性尿道炎，依靠FQ-PCR準確診斷病原微生物，選擇敏感藥物有針對性地進行有效治療。TP近年來在我國增長迅速，顯性和隱性梅毒患者均可是傳染源，且潛伏TP居多，已成為報告病例數較多的性病之一。HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，能引起人體皮膚、黏膜的鱗狀上皮增殖。最多見的是低危6/11型及高危16/18型，高危型HPV持續感染也已被證明是導致宮頸癌的主要危險因素[8-10]。近年來性傳播疾病發病率越來越高，發病年齡卻逐年降低。防治性病更應教導青少年尊崇傳統的道德倫理觀念，加強青春期正確性教育和性病預防知識，培養良好的衛生習慣，從根本上減少性傳播疾病的發生。

FQ-PCR反應體系中有2條普通的特異性引物，1條熒光標記探針，這條探針的5′端和3′端分別標記供體熒光報告基團和受體熒光淬滅基團，探針完整時，供體報告基團發射的熒光能量傳遞給相近的受體熒光染料并被吸收，進而激發出另一波長并能同時淬滅供體基團發射的熒光；TaqDNA聚合酶不僅有延伸DNA的引物活性，還有5′～3′外切核酸酶活性，擴增循環過程中，Taq酶的外切酶活性將探針酶切降解，使報告和淬滅2個熒光基團分離，熒光信號得到釋放，自動監測系統可接收到發射熒光，擴增目的DNA鏈越多，熒光分子釋放越多，實現熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。由于PCR擴增指數時期，模板CT值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量依據。多種病原微生物在同一反應條件下同時進行擴增檢測，顯著提高效率，在保障敏感性和特異性的前提下，不僅檢測出感染病原微生物的種類，而且提示局部病原微生物的感染量級水平，對病情發展和預后能夠進行有針對性的治療及監測。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.051

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1673-4130(2016)20-2919-03

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