蛙血清小分子肽的分離鑒定及生物活性檢測

陳博 謝琳

1.廣東醫科大學東莞校區生理科學實驗室，廣東東莞523808；

2.廣東醫科大學東莞校區基礎醫學院，廣東東莞523808

蛙血清小分子肽的分離鑒定及生物活性檢測

陳博1謝琳2▲

1.廣東醫科大學東莞校區生理科學實驗室，廣東東莞523808；

2.廣東醫科大學東莞校區基礎醫學院，廣東東莞523808

目的分離和鑒定蛙血清去蛋白提取物中的小分子肽，檢測其生物活性。方法用超濾法收集蛙血清中相對分子質量為1000～3000的組分；用RP-HPLC對超濾組分進行分離純化；用串聯質譜法分析鑒定小分子肽的分子質量；用呼吸檢壓儀測定并計算肝細胞呼吸活性和刺激指數。結果將相對分子質量為1638的小分子肽的二級質譜數據經處理后在數據庫搜索，沒有搜索到相關肽的信息，可能是新發現的肽。呼吸活性檢測顯示小分子肽有很強的呼吸活性，氧系數（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），刺激指數（SI）≥2.5，強于小牛血清去蛋白注射液。結論蛙血清小分子肽是一種新發現的肽，相對分子質量為1638，其藥效可能優于小牛血清去蛋白注射液。

蛙血清；小分子肽；呼吸活性

研究表明，動物血清的主要藥理活性成分是小分子肽［1］。筆者的前期研究發現蛙血清去蛋白提取物能提高心、腦組織對缺氧的耐受力［2］，能保護心、腦缺血再灌注損傷［3-4］，說明其含有對心腦缺血缺氧性損傷有保護作用的小分子肽類物質。因此，本研究從蛙血清去蛋白提取物中分離并純化其中的小分子肽，鑒定小分子肽的分子質量，以期確定其分子結構和名稱，并通過測定和計算小分子肽的呼吸活性和刺激指數（SI），探討該小分子肽的藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性豚鼠1只，體重250～350 g，由廣東醫學院實驗動物中心提供［合格證號：SYXK（粵）2013-0007］。

1.2 藥品試劑

色譜純乙腈（北京匯海科儀科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，Sigma公司）；10%氫氧化鈉溶液（分析純，廣州化學試劑廠）；Soerensen緩沖液（0.0667 mol/L）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O，分析純，廣州化學試劑廠）9.72 g和磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純，廣州化學試劑廠）1.65 g加雙蒸水至1000 m L，磷酸調pH值到7.4；Brodie測壓液：取氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）23 g，牛膽酸鈉（分析純，北京化學試劑公司）5 g，伊文蘭（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）100mg，加雙蒸水至500mL；小牛血清去蛋白注射液（參考對照藥，錦州奧鴻藥業有限公司，規格：5mL∶0.2 g）。

1.3 儀器設備

光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Ultraflex TOF/ TOF型MALDI-TOFMass（Matrix-assisted Laser Desorption/ioniza-tion time-of-flight）質譜儀（德國Bruker）；MILLIPORE8400超濾杯（MILLIPORE），RMM1000和RMM3000超濾膜（MILLIPORE）；SKW-3微量呼吸檢壓儀器（上海大學）；YQ3型高速勻漿機（江蘇江陰縣祝塘儀器廠）；恒溫水浴箱（余姚電訊儀表實業公司）；旋渦混勻器（江蘇海門麒麟醫用儀器廠）。

1.4 蛙血清小分子肽的分離和鑒定

1.4.1 超濾蛙血離心取上清，乙醇去蛋白，蒸餾回收乙醇，得蛙血清去蛋白提取物。將其倒入超濾杯中進行超濾［5］。用截留相對分子質量為3000的超濾膜超濾，收集濾過液，再用截留相對分子質量為1000的超濾膜超濾，收集濾膜上保留液，低溫保存。

1.4.2 RP-HPLC分離純化分離柱：Sepax C18柱；洗脫液A為0.1%三氟乙酸（TFA）/H2O，洗脫液B為0.1%三氟乙酸（TFA）/乙腈；流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，柱溫箱溫度為40℃。每次上樣100μL，收集洗脫峰，用質譜儀鑒定洗脫峰中物質的分子量［6］。

1.4.3 質譜分析在MALDI-TOF/TOF Mass質譜儀上進行一級質譜（MS）和串聯質譜（MS/MS）分析［6］。CCA基質：0.1%TFA、50%ACN、50%H2O。取1μL樣品與3μLCCA基質混合均勻，取0.5μL混合液在按規律分別在板上點樣，風干后送入機內檢測。MS：正離子檢測模式，離子源加速電壓為20 kV，N2激光波長337 nm，脈沖寬度3 ns，離子延遲提取150 ns，真空度4×10-7Torr。轉化MS/MS模式后，將滿足MS的離子進行串聯質譜分析，MS/MS模式的m/z范圍為0～3000。

1.4.4 小分子肽的鑒定用Mascot軟件的串級質譜數據和序列標簽進行搜索鑒定［8］。

1.5 蛙血清小分子肽呼吸活性的測定

1.5.1 肝勻漿的制備雄性豚鼠1只，體重295 g，禁食24 h后頸椎脫臼處死，頸動脈放血，開腹取出肝臟，置冰水浴中的Soerensen緩沖液中。稱取5.5 g的肝臟，并切割為大小相同的7塊，每塊用7 mL的Soerensen緩沖液勻漿。以上操作均在冰水浴中進行。

1.5.2 測定方法把測壓計和反應瓶洗凈，干燥。裝好測壓液于測壓計內，調節液面至150 mm。準備供校正用溫壓計1套，空白組裝置2套，對照組裝置2套和供試品組裝置2套。每個反應瓶中間小杯（內含1小濾紙條）加10%氫氧化鈉溶液0.2mL。除供校正用溫壓計反應瓶只加Soerensen緩沖液2.5 m L外，其他每個反應瓶中均加入Soerensen緩沖液1.lmL和肝勻漿1.0 mL。空白組瓶中再加入Soerensen緩沖液0.2 m L，對照組瓶中加入參考對照藥小牛血清去蛋白注射液0.2mL［9］，供試品組瓶中加入蛙血清小分子肽0.2mL。

將裝好的密閉反應瓶與測壓計相連，置37℃恒溫水浴中。將測壓計右側柱液面調至150mm，記下左側液面初讀數（A），反應30min后將測壓計右側柱液面再調至150mm，記下左側液面讀數（B）。重復上述操作，進行下一個30 min的反應并記下左側液面初讀數（C）及30min后的液面讀數（D）。實驗過程中須觀察供校正用溫壓計的壓力的變化（ΔC），以消除試驗過程中溫度及大氣壓的影響［10］。取2.0mL肝勻漿，置恒重的裝有海沙的稱量瓶中，110℃干燥至恒重，計算兩次的重量差ΔW（mg）。

1.5.3 計算呼吸活性計算公式［11］：QO2［μLO2/（mg·h）］=［（A-B+C-D）×K1-ΔC×K2］/G×I。公式中：QO2為氧系數；A、B、C、D為測壓計的讀數；K1為空白或樣品的反應瓶常數；K2為溫壓計的反應瓶常數；ΔC為校正溫壓計的體積變化；G為每l毫升肝勻漿的干重，G=ΔW/2-9.3，9.3為Soerensen緩沖液的干重，單位mg；I為反應時間，單位h。

K1、K2計算公式為：｛［（VR+VM）×1000-2500］×273/（273+37）+2500×0.0239｝/10000。公式中：VR為反應瓶體積；VM為測壓計體積；2500為瓶內液體體積（μL）；0.0239為37℃時氧的溶解度。

試驗結果必須滿足以下條件［12］：對照品組的QO2≥4.0μLO2/（mg·h）并且SI≥2.5；空白組的QO2≥1.0μLO2/（mg·h）。

2 結果

2.1 蛙血清超濾組分的RP-HPLC圖譜

蛙血清超濾組分經RP-HPLC分離純化，結果見圖1。215 nm波長下，有7個洗脫峰。收集所有的洗脫峰。

2.2 蛙血清超濾組分洗脫峰的質譜圖譜

將收集的RP-HPLC洗脫峰成分進行質譜檢測，發現峰位22min的洗脫峰為高純度肽。22min洗脫峰中相對分子質量為1638的肽的一級質譜圖譜見圖2，其相對應的二級質譜圖譜見圖3。

2.3 蛙血清小分子肽的數據庫搜索鑒定結果

將相對分子質量為1638的小分子肽的二級質譜數據經處理后在數據庫搜索，沒有搜索到相關肽的信息，可能是新發現的肽。

圖1 蛙血清相對分子質量1000～3000超濾組分的RP-HPLC圖譜

圖2 蛙血清相對分子質量1000～3000超濾組分RP-HPLC圖譜上22 m in洗脫峰的MS圖譜

圖3 相對分子質量為1638的小分子肽的MS/MS圖譜

2.4 蛙血清小分子肽的呼吸活性測定結果

檢測的空白組、對照組及5組蛙血清小分子肽樣品結果見表1，通過公式計算，得空白組的耗氧量為2.1［QO2≥1.0μLO2/（mg·h）］，對照組的耗氧量為6.4［QO2≥4.0μLO2/（mg·h）］，SI 3.0（≥2.5），均滿足試驗成功的條件。結果（表2）顯示：蛙血清小分子肽的刺激指數大于小牛血清去蛋白注射液，表明蛙血清小分子肽比小牛血清去蛋白注射液的藥效要更好。

表1 溫壓計、空白組、對照組和蛙血清小分子肽檢測結果

表2 呼吸活性QO2值和刺激指數SI值

3 討論

血清小分子肽是指血清中所有相對分子質量低于10 000的小分子蛋白質片段和多肽集合，具有低抗原等特性使其容易被吸收，并參與到細胞的新陳代謝中去，促進體內的新陳代謝［13］。但相對分子質量5000以下的血清小分子肽研究較少［14］，因為血清中大分子蛋白含量高，而且還與一些小肽結合在一起，使得分離純化較難，而相對分子質量在1000～3000的肽含量雖少，但不與大分子蛋白結合，分離提純比較容易［15］。

本研究選擇兩棲類的青蛙的血液進行研究，是考慮到蛙在冬眠時血液流動雖然很緩慢甚至停滯，但不會發生凝固和栓塞［16］，而秋冬寒冷季節人們腦梗塞的發病率更是明顯升高，由此推測蛙血清中必定含有能維持細胞能量代謝的肽類物質，因此本研究在前期研究的基礎上［3］，從蛙血清去蛋白提取物中分離相對分子質量為1000～3000間的小分子肽，鑒定其中純度高的小分子肽的相對分子質量，以期確定其分子結構和名稱。目前國內外對蛙血清的研究僅限于在血清生化指標方面的檢測，尚未有在蛙血清中提純小分子肽的相關研究報道，更無相對分子質量在1000～3000的小分子肽的研究。本研究通過RP-HPLC分離結果和質譜結果表明，蛙血清相對分子質量為1000～3000超濾組分中含有一種純度高達99.2%的小分子肽，為22min洗脫峰中相對分子質量為1638的小分子肽，其他的洗脫峰純度都不高，且混合存在多種小分子肽類物質，即使進行研究也無法說明其有效作用成分，所以必須選擇高純度的小分子肽進行研究。該小分子肽通過二級質譜分析，其二級質譜數據通過軟件在蛋白質/肽類數據庫中未檢索到對應信息，也就是說很可能為新發現的一種小分子肽。研究后期將用Edman降解法測序，以期能獲得這種小分子肽的氨基酸序列。

血清小分子肽生物活性的檢測指標是呼吸活性和刺激指數［17］，可以反映出小分子肽對細胞的代謝作用［18］。本研究用豚鼠肝細胞為底物測定，用呼吸檢壓儀測定肝勻漿的呼吸活性和刺激指數。該檢測系統簡單靈敏專一，客觀可靠［19］。檢測結果顯示，小分子肽的5個樣品的刺激指數均符合國家規定標準（SI≥2.5），并且各樣品的小分子肽的刺激指數均比小牛血清去蛋白注射液的刺激指數更高，說明小分子肽在促進細胞能量代謝和細胞修復方面的藥效要優于小牛血清去蛋白注射液。

小分子肽類藥物使用起來具有針對性強、療效顯著、副作用小等優點，成為新型藥物開發的重要方向［20］。在本研究中，通過分離、提純、鑒定，發現了蛙血清中的一種新的相對分子質量為1638的小分子肽，并檢測了其呼吸活性和刺激指數，結果表明其藥效要優于小牛血清去蛋白注射液。因此，若能將其開發應用，必定具有很好的社會效益。

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Isolation and identification and biological activity detection of small molecular peptides in frog serum

CHEN Bo1XIE Lin2▲
1.Laboratory of Physiology Science，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China；2.Basic Medical College，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China

Ob jective To isolated and identificated of small molecular peptide from the deproteinized frog serum extract，in order to detect its biological activity.Methods Collecting the components with relative molecular weight of 1000-3000 in frog serum was used ultrafiltration；separating and purificating the ultrafiltration components was used RP-HPLC；themolecularweight of smallmolecular peptideswas analyzed and identified by tandem mass spectrometry；the respiratory activity and stimulation index of liver cellsweremeasured and calculated by respiratory pressure detector.Results The second stagemass spectrometry data of smallmolecular peptide with relativemolecular weight of 1638 was disposed，and then itwas searched in the database，there was no relevant peptide information，maybe itwas a new discovery of the peptide.Detection of respiratory activity showed smallmolecular peptides had very strong respiratory activity，oxygen quotient（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），and stimulation index（SI）≥2.5，itwas stronger than in calf serum to protein injection.Conclusion The frog serum small molecular peptide is a newly discovered peptide，the relative molecular weight is 1638，the efficacy of the drug is better than that of calf serum albumin injection.

Frog serum；Smallmolecular peptide；Respiratory activity

R96

A

1673-7210（2016）05（a）-0016-05

2016-02-01本文編輯：蘇暢）

廣東醫學院青年基金項目（Q2010003）；廣東醫學院大學生創新實驗項目（2015ZYDS005）

▲通訊作者