截短型p63基因沉默對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響

莫慶榮 喻亞群 李淑群 陳謙 廖維甲

?

·論著·

截短型p63基因沉默對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響

莫慶榮 喻亞群 李淑群 陳謙 廖維甲

目的 觀察截短型p63(ΔNp63)基因沉默對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響。方法 采用實時PCR檢測23例胰腺癌及其配對癌旁正常胰腺組織ΔNp63mRNA的表達；采用蛋白質印跡法檢測人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE6-C7及人胰腺癌細胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC3的ΔNp63蛋白表達。采用脂質體法將靶向ΔNp63的siRNA(ΔNp63-siRNA)及對照siRNA(Con-siRNA)轉染PANC1細胞，以未轉染的PANC1細胞作為對照組，檢測轉染細胞ΔNp63 mRNA及蛋白表達以驗證ΔNp63基因沉默效應。采用MTT法和BrdU法檢測轉染細胞的增殖及DNA合成能力的變化。結果 23例胰腺癌及配對癌旁正常胰腺組織ΔNp63 mRNA表達量分別為0.99±0.07、0.70±0.07，癌組織的表達量顯著高于正常胰腺組織，差異有統計學意義(P=0.0034)。HPDE6-C7及PANC1、CFPAC-1、BxPC3細胞ΔNp63蛋白表達量分別為0.97±0.09、3.06±0.16、2.57±0.11、2.45±0.08，3株胰腺癌細胞的表達量較HPDE6-C7細胞升高，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。對照組、Con-siRNA組、ΔNp63-siRNA組PANC1細胞ΔNp63mRNA表達量分別為0.97±0.07、0.97±0.07、0.28±0.03，蛋白表達量分別為0.97±0.06、1.00±0.10、0.26±0.03，ΔNp63-siRNA組均較Con-siRNA組顯著下調，差異有統計學意義(P值均<0.01)。ΔNp63-siRNA組細胞生長受到抑制，與Con-siRNA組及對照組差異均有統計學意義(P值均<0.01)。3組培養24 h時DNA合成量(A490值)分別為0.55±0.04、0.56±0.01、0.55±0.00；培養48 h時分別為0.84±0.05、0.87±0.07、0.71±0.05。48 h時ΔNp63-siRNA組細胞DNA合成能力較Con-siRNA組及對照組顯著下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而Con-siRNA組與對照組間的差異無統計學意義。結論 沉默ΔNp63基因可顯著抑制胰腺癌PANC1細胞的增殖及DNA合成。

胰腺腫瘤； 基因沉默； 基因，p53； 細胞增殖

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81260328)；the universities Science and Technology Research Foundation of Guangxi (LX2014251)； the Science and Technology Planning Project of Guilin (20120121-1-15)；Guangxi health department key scientific research project funds(key project2012005)

胰腺癌是消化道的惡性腫瘤之一，其病因和發病的分子機制尚不明確[1-2]。近年來，癌基因或抑癌基因變異引起的相關功能因子表達紊亂而導致胰腺癌發生和發展的分子機制研究成為重要方向[3-4]。p63是腫瘤抑制基因p53家族成員，它的某些亞型被認為是腫瘤抑制基因，而另一些亞型被認為是致癌基因。截短型p63(ΔNp63)作為p63的同源體，在多種腫瘤中表現為致癌功能。有研究報道，ΔNp63可通過調節腫瘤血管生成促進小兒神經母細胞瘤和骨肉瘤生長[5]。另有研究報道，在膀胱癌中ΔNp63通過特定的下游基因誘發癌細胞的侵襲力，沉默ΔNp63基因表達可降低UMUC3細胞的浸潤和轉移[6]。但有關ΔNp63在胰腺癌中的作用尚未見文獻報道。本研究擬從細胞、分子和組織3個層面探討ΔNp63對胰腺癌細胞增殖的調控作用。

材料與方法

一、實時PCR檢測ΔNp63 mRNA表達

選取2011年12月至2014年12月間桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科手術治療并經病理診斷證實的23例胰腺癌組織及其配對癌旁正常胰腺組織?；颊咝g前均未進行任何放、化療或免疫治療。手術后0.5～1 h內迅速取組織凍存于液氮備用。取約50 mg的組織塊置研缽中研磨成粉末狀，采用Trizol抽提組織總RNA。應用分光光度計測定樣本A260、A280值鑒定RNA純度，計算RNA濃度。取50 μg總RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板、以GAPDH為內參進行PCR反應。ΔNp63上游引物為5′-TGCCCAGACTCAATTTAGTGAG-3′，下游引物為5′-TCTGGATGGGGCATGTCTTTGC-3′，擴增片段335 bp；GAPDH上游引物為5′-CGCATAGCATACGGCT-3′，下游引物為5′-GGCATGACTCCGATTG-3′，擴增片段140 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 20 s，40個循環。使用BIO-RAD實時PCR儀自帶軟件獲取Ct值，采用公式2-ΔΔCT計算RNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

二、蛋白質印跡法檢測ΔNp63蛋白表達

人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE6-C7及人胰腺癌細胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC3均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。細胞復蘇后常規培養、傳代。應用裂解液提取各組對數生長期細胞的蛋白質，Bradford法定量蛋白。取10 μg蛋白常規行蛋白質印跡法檢測ΔNp63蛋白表達量，以GAPDH為內參。鼠抗ΔNp63及GAPDH多抗均購自美國Abcam公司，工作濃度為1∶500、1∶200；抗鼠辣根過氧化物酶標記的IgG購自上海朗頓生物科技有限公司，工作濃度1∶1 600。最后ECL化學發光，X光膠片曝光、顯影、定影。用圖像分析系統掃描條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、siRNA轉染PANC1細胞

取對數生長期PANC1細胞，以每孔2×105個接種于6孔板，待細胞融合至70%～80%時更換無血清培養基，采用Lipo-2000將靶向ΔNp63的siRNA(ΔNp63-siRNA)及對照siRNA(Con-siRNA)轉染PANC1細胞，以未轉染的PANC1細胞作為對照組。ΔNp63-siRNA、Con-siRNA均購自美國Bio Systems公司，細胞轉染試劑Lipo-2000購自美國Life Technology公司。按試劑盒說明書操作。采用實時PCR法及蛋白質印跡法檢測轉染細胞ΔNp63mRNA及蛋白表達以鑒定基因沉默效應。

四、MTT檢測細胞增殖

收集對數生長期的PANC1細胞及ΔNp63-siRNA、Con-siRNA轉染的PANC1細胞，調節細胞懸液密度為1×105/ml。取100 μl細胞懸液接種于96孔板，每組設5個復孔。共接種6塊培養板，分別常規培養0、1、2、3、4、5 d，到時間點時每孔加入10 μl 0.5% MTT溶液，繼續培養4 h，1 000轉離心10 min，小心吸掉孔內上清液，加入100 μl二甲基亞砜，低速振蕩10 min，上酶聯免疫檢測儀測各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490值)。以單加MTT、培養基、二甲基亞砜的孔調零。

五、BrdU法檢測細胞DNA合成能力

取上述各組PANC1細胞，以2×103/ml細胞數接種于96孔板培養1 d，用含0.4% FCS培養液同步化2 d，使絕大多數細胞處于G0期。然后分別培養24、48 h，到培養時間點時加入終濃度為10 μmol/L的BrdU，繼續37℃孵育24 h，棄培養液，4%冷的多聚甲醛固定細胞30 min，加過氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗體(Sigma-Aldrich公司)60 min，PBS洗滌3次后加過氧化物酶底物(四甲基聯苯胺)染色30 min，測各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490值)。

六、統計學處理

結果

一、胰腺癌組織及細胞中ΔNp63的表達

23例胰腺癌及配對的癌旁正常胰腺組織ΔNp63 mRNA表達量分別為0.99±0.07、0.70±0.07，癌組織的表達量顯著高于正常胰腺組織，差異有統計學意義(t=2.684,P=0.0034)。

HPDE6-C7細胞及人胰腺癌PANC1、CFPAC-1、BxPC3細胞ΔNp63蛋白表達量分別為0.97±0.09、3.06±0.16、2.57±0.11、2.45±0.08，胰腺癌PANC1、CFPAC-1、BxPC3細胞均顯著高于HPDE6-C7細胞，差異有統計學意義(P值均<0.01，圖1)。

二、ΔNp63-siRNA轉染對PANC1細胞的基因沉默效應

對照組、Con-siRNA組、ΔNp63-siRNA組PANC1細胞ΔNp63 mRNA表達量分別為0.97±0.07、0.97±0.07、0.28±0.03；蛋白表達量分別為0.97±0.06、1.00±0.10、0.26±0.03(圖2)。ΔNp63-siRNA組PANC1細胞ΔNp63mRNA表達量較Con-siRNA組下調約75%，蛋白表達量下調約80%，差異有統計學意義(t=8.881，P=0.0009;t=7.417,P=0.0018)，而Con-siRNA組與對照組的差異無統計學意義。

圖1 HPDE6-C7(1)、PANC1(2)、CFPAC-1(3)、BxPC3(4)細胞ΔNp63蛋白表達

圖2 對照組(1)、Con-siRNA組(2)、ΔNp63-siRNA組(3)PANC1細胞的ΔNp63蛋白表達

三、ΔNp63基因沉默對PANC1細胞增殖及DNA合成的影響

ΔNp63-siRNA組細胞生長曲線較Con-siRNA組及對照組顯著下降，差異有統計學意義(t=14.4242，P=0.0001；t=11.0147,P=0.0004；圖3)。對照組、Con-siRNA組、ΔNp63-siRNA組培養24 h時的DNA合成量(A490值)分別為0.55±0.04、0.56±0.01、0.55±0.00；培養48 h時分別為0.84±0.05、0.87±0.07、0.71±0.05。3組培養24 h時的DNA合成能力差異無統計學意義，培養48 h時，ΔNp63-siRNA組細胞DNA合成能力較Con-siRNA組及對照組顯著下降，差異均有統計學意義(t=4.071，P=0.0309；t=3.182,P=0.0354)。

討論

據《2013年中國腫瘤登記年報》統計，胰腺癌位列我國男性惡性腫瘤發病率的第8位，人群惡性腫瘤死亡率的第7位，全球范圍內均呈快速上升趨勢。胰腺的腫瘤大多是外分泌型腫瘤，80%是胰腺導管腺瘤，只有2%的胰腺外分泌腫瘤為良性[7]。胰腺癌以高侵襲性和早期轉移為特點，臨床癥狀出現晚，發現時多為晚期，很難施行治愈性的手術治療，預后較差。近幾年胰腺癌在我國發病率逐年上升，并且有年輕化的趨勢。雖然放療和化療對延長患者生存期起到了一定的作用，但是患者中位生存期仍小于2年[8]。

圖3 ΔNp63-siRNA轉染對ΔNp63細胞增殖的影響

p63不僅對各種上皮細胞的正常發生、分化及維持細胞形態具有重要功能，而且在促進癌細胞凋亡方面也扮演重要角色。p63基因是p53基因家族成員，定位于第3q27～3q29，包含15個外顯子。它在兩個不同的啟動子控制下編碼兩類轉錄產物：一類為全長型p63(TAp63)，另一類為截短型p63(ΔNp63)。ΔNp63不具有轉錄啟動活性，但可以抑制TAp63和p53依賴的靶基因的轉錄，且不誘導細胞凋亡，充當致癌基因的角色[9]。以往研究發現，ΔNp63 mRNA在卵巢癌、鼻咽癌、鱗癌和其他上皮來源的良性腫瘤、軟垂疣、平疣中表達[10]。而沉默多種腫瘤細胞ΔNp63基因表達可抑制癌細胞的生長和增殖，所以ΔNp63一直是多種治療策略的關鍵點[11-12]。

本研究結果顯示，胰腺癌組織及多株胰腺癌細胞株均高表達ΔNp63，通過RNA干擾技術沉默ΔNp63基因表達，可以抑制胰腺癌細胞的增殖和DNA合成，提示 ΔNp63可促進胰腺癌細胞的增殖。

[1] Rivera JA, Graeme-Cook F, Werner J, et al. A rat model of pancreatic ductal adenocarcinoma: targeting chemical carcinogens[J]. Surgery, 1997, 122(1):82-90.

[2] Song SY. Etiology and carcinogenesis of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Korean J Gastroenterol, 2008, 51(2):71-83. DOI:200802252.

[3] Park JY, Helm J, Coppola D,et al. MicroRNAs in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(7):817-827. DOI: 10.3748/wjg.v17.i7.817.

[4] Seux M, Iovanna J, Dagorn JC, et al. MicroRNAs in pancreatic ductal adenocarcinoma: new diagnostic and therapeutic clues[J]. Pancreatology, 2009, 9(1-2):66-72. DOI:10.1159/000178876.

[5] Bid HK, Roberts RD, Cam M, et al.DeltaNp63 promotes pediatric neuroblastoma and osteosarcoma by regulating tumor angiogenesis[J]. Cancer Res, 2014, 74(1):320-329. DOI: 10.1158/0008-5472.

[6] Jing P, Zou J, Zhang J, et al. DeltaNp63 promotes UMUC3 cell invasiveness and migration through claudin1 in vitro[J]. Mol Med Rep, 2013, 7(3):1026-1030. DOI: 10.3892/mmr.2013.1271.

[7] Gerritsen A, Molenaar IQ, Bollen TL, et al. Preoperative characteristics of patients with presumed pancreatic cancer but ultimately benign disease: a multicenter series of 344 pancreatoduodenectomies[J]. Ann Surg Oncol, 2014, 21(12):3999-4006.DOI: 10.1245/s10434-014-3810-7.

[8] Yu CK, Yu SN, Lu ZH, et al.Research advances in microRNA in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao, 2011, 33(5):575-581.

[9] Nylander K, Coates PJ, Hall PA. Characterization of the expression pattern of p63 alpha and delta Np63 alpha in benign and malignant oral epithelial lesions[J]. Int J Cancer, 2000, 87(3):368-372.

[10] Zeimet AG, Marth C. Why did p53 gene therapy fail in ovarian cancer[J]? Lancet Oncol, 2003, 4(7):415-422. DOI: S1470204503011392.

[11] He ZX, Li YN, Liu LK,et al.Expression of deltaNp63 in salivary gland tumours[J]. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2006, 37(1):126-128.

[12] Yamaguchi K, Wu L, Caballero OL,et al.Frequent gain of the p40/p51/p63 gene locus in primary head and neck squamous cell carcinoma[J]. Int J Cancer, 2000, 86(5):684-689.

(本文編輯：呂芳萍)

The effect of ΔNp63 knockdown on the growth of pancreatic cancer PANC1 cells

MoQingrong,YuYaqun,LiShuqun,ChenQian,LiaoWeijia.

DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001,ChinaCorrespondingauthor:YuYaqun,Email: 260591484@qq.com

Objective To investigate the effect of deltaNp63(ΔNp63) silencing on the proliferation of pancreatic cancer PANC1 cells. Methods ΔNp63 mRNA level in 23 pairs of pancreatic cancer and adjacent tissue specimen was detected by real-time PCR, and ΔNp63 protein in human normal pancreatic ductal cell line HPDE6-C7 and pancreatic cancer cell line PANC1, CFPAC1 and BXPC3 was detected by Western blot. PANC1 cells were transfectedΔNp63 specific siRNA (ΔNp63-siRNA) and scramble siRNA (Con-siRNA) using liposome, and untransfected cells served as control.ΔNp63 mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blot to validate the silencing ofΔNp63 expression. MTT assay and BrdU method were used to detect the proliferation and DNA synthesis of transfected PANC1 cells. Results The ΔNp63 mRNA expression

Pancreatic neoplasms; Gene silencing; Genes, p53; Cell prdiferation

國家自然科學基金(81260328)；廣西高校科學技術研究基金(LX2014251)；桂林市科技開發課題基金(20120121-1-15)；廣西衛生廳重點科研課題基金(重2012005)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.05.005

541001 廣西桂林，桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科

喻亞群，Email: 260591484@qq.com

in pancreatic cancer tissues and matched adjacent normal tissues was 0.99± 0.07and 0.70±0.07, respectively. ΔNp63 mRNA expression in pancreatic cancer tissue was significantly up-regulated compared with that in the normal tissue (P=0.0034). The ΔNp63 protein expression in HPDE6-C7, PANC1, CFPAC-1 and BxPC3 cells was 0.97±0.09,3.06±0.16,2.57±0.11 and2.45±0.08, respectively. TheΔNp63 protein level in pancreatic cancer cells were higher than that in HPDE6-C7 cells (P<0.001). ΔNp63 mRNA level in control, Con-siRNA and ΔNp63-siRNA group was 0.97±0.07,0.97±0.07 and0.28±0.03, respectively, and ΔNp63 protein expression level was 0.97±0.06,1.00±0.10 and 0.26±0.03. The expression of ΔNp63 mRNA and protein inΔNp63-siRNA group were significantly down-regulated comparing with those in Con-siRNA group (P<0.01). Significant inhibition on cell proliferation was observed in ΔNp63-siRNA group, which was statistically different from that in control and Con-siRNA group. TheA490value (DNA synthesis) of control, Con-siRNA and ΔNp63-siRNA group was 0.55±0.04, 0.56±0.01 and 0.55±0.00 at 24 h after transfection, and 0.84±0.05,0.87±0.07 and0.71±0.05 at 48 h after transfection. The DNA synthesis in ΔNp63-siRNA group was significantly down-regulated compared with that in control and Con-siRNA group (P<0.05). Conclusions Knockdown of ΔNp63 could greatly inhibit the proliferation and DNA synthesis of pancreatic cancer PANC1 cells.

2016-02-15)