滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠血糖及血液流變學的影響

俞 浩， 張孝林， 熊友誼， 馬世堂

(安徽科技學院食品藥品學院，安徽 蚌埠 233100)

中藥配伍應用是中醫臨床用藥的基本特點，將中藥的有效部位進行合理配伍、組方，即中藥的“有效部位配伍”，對于探究中藥復方配伍的新模式，豐富中醫藥理論內涵具有重要意義[1-2]。滁菊ChrysanthemummorifoliumRamat.含有黃酮、多糖、揮發油等多種成分，其中滁菊總黃酮(Chrysanthemummorifoliumflavonoids,CMF)是其主要活性成分之一，具有抗大鼠心肌缺血和心肌缺血再灌注損傷作用，并能改善血液流變學異常[3-6]。白背三七Gynuradiuaricata(L.) DC.含有黃酮、多糖等成分，研究表明，白背三七總黃酮(Gynuradiuaricataflavonoids,GDF)具有改善糖尿病大鼠高血糖癥狀和脂質代謝異常，抗氧化等作用[7-9]。本實驗將滁菊總黃酮和白背三七總黃酮進行配伍，觀察該配伍對糖尿病血瘀證大鼠血糖和血液流變學相關指標的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 滁菊總黃酮(總黃酮含有量為76.38%)，白背三七總黃酮(總黃酮含有量為57.3%)，均為安徽科技學院中藥及藥物制劑實驗室制備；糖脈康，中國中醫研究院(成都中匯制藥有限公司，批號110107)；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，用時以0.1 mol/L pH 4.2無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成1%STZ溶液，Sigma公司)；血糖試紙(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；鹽酸腎上腺素注射液(北京永康藥業有限公司，批號11103029)；強的松龍注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號111225)；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP二鈉鹽，Alexis公司產品)，用時以0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制成1 mmol/L的溶液；花生四烯酸(arachidonic acid，AA，Cayman公司產品)，用時以1%的Na2CO3溶液稀釋；凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定試劑盒、凝血酶時間(thrombin time，TT)測定試劑盒、活化部分凝血活酶時間(activeated partial thromboplastin time，APTT)測定試劑盒、纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器 DL-5低速離心機(鄭州長城科工貿易有限公司)；FA21048電子天平(上海市精密科學儀器有限公司)；血糖試紙(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；安穩血糖測試儀(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；LBY-NJ2血小板凝聚儀(北京普利生公司)；LBY-N6全自動血流變儀(北京普利生公司)；ACL Futura Plus全自動血凝儀(美國IL公司)。

1.3 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠，體質量220～260 g，購于安徽長臨河醫藥科技有限公司，合格證號為：SCXK(皖)2011-002。

1.4 模型制備 參照文獻方法并適當加以改良復制糖尿病血瘀證大鼠模型[10-11]。取大鼠100只，10只留作正常對照，飼喂普通飼料。另90只大鼠飼喂高脂飼料(膽固醇1.0%，豬油10.0%，膽酸0.3%，基礎飼料88.7% )，連續28 d。將大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈注射STZ(劑量為35 mg/kg)。注射STZ后72 h，尾靜脈采血測定FBG，選擇FBG在16.8～25.0 mmol/L之間的大鼠作為糖尿病大鼠。然后給糖尿病大鼠肌內注射0.1%強的松龍，0.3 mL/只，每日1次,共13 d。第14天皮下注射0.1%腎上腺素，0.1 mL/只，即得2型糖尿病血瘀證模型大鼠。

1.5 動物分組及給藥 取糖尿病血瘀證模型大鼠50只，結合FBG和體質量，采用隨機分組法將模型大鼠分為5組，即滁菊總黃酮組(劑量為40 mg/kg)，白背三七總黃酮組(劑量為120 mg/kg)，滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組(劑量為滁菊總黃酮40 mg/kg+白背三七總黃酮120 mg/kg)，糖脈康組(劑量為1.8 g/kg)和模型對照組，并設正常對照組，每組10只。灌胃給藥，容量均為0.5 mL/100 g體質量，每日1次，連續給藥4周，正常對照組和模型對照組灌胃等容量的生理鹽水。

1.6 檢測指標

1.6.1 體質量測定 分別于給藥第2周、第4周末測定大鼠體質量。

1.6.2 FBG水平測定 給藥第4周末，各組大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測定大鼠FBG。

1.6.3 全血黏度、血漿黏度測定 給藥第4周末，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動脈采血，將3 mL血分別置2支抗凝管中，制備全血和血漿。分別取全血和血漿各0.8 mL測定全血和血漿黏度。

1.6.4 血沉和紅細胞壓積測定 大鼠腹主動脈采血，20 kU/L肝素鈉抗凝制備全血，取抗凝血置于長200 mm，內徑為2.5 mm清潔、干燥的標準魏氏血沉管中，調至“0”刻度，將血沉管置管架上，室溫放置1 h，記錄紅細胞的沉降距離(mm)。將1 mL抗凝血緩慢加入比積管內，3 500 r/min離心30 min，再離心10 min，至紅細胞不再沉降，記錄紅細胞層的高度，計算紅細胞壓積。

1.6.5 凝血參數測定 大鼠腹主動脈采血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)，取抗凝血，按照試劑盒說明書操作方法，采用全自動血凝儀測定凝血酶原時間、活化部分凝血酶時間、凝血酶時間和纖維蛋白原水平。

1.6.6 血小板聚集率測定 取3.8%枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，120×g離心10 min，取上清部分即富血小板血漿(PRP)，余血1 200×g離心10 min，取上清部分即貧血小板血漿(PPP)。調PRP中血小板密度為600×109個/L。按照Born氏比濁法，將加有300 μL PRP和小磁棒的比濁管置于血小板聚集儀恒溫孔中，37 ℃預熱5 min，用PPP調零后，在攪拌情況下分別加入ADP(終濃度為10.0 μmol/L)和AA(終濃度為330.0 μmol/L)誘導聚集，測定血小板聚集率。

2 結果

2.1 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠體質量的影響 由表1可知，給藥第2周末，與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質量顯著減輕(P<0.05)，各給藥組大鼠體質量與模型對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。給藥第4周末，滁菊總黃酮組、白背三七總黃酮組大鼠體質量與模型對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組大鼠體質量有增加趨勢，與模型對照組比較具有顯著性差異(P<0.01)。說明滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍能抑制糖尿病血瘀證大鼠體質量減輕。

2.2 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠FBG的影響 由表2可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血糖顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，白背三七總黃酮組、滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組大鼠FBG均顯著下降(P<0.01)，其中滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍降血糖作用顯著強于白背三七總黃酮(P<0.01)，說明滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍能夠起到協同作用。滁菊總黃酮無降血糖作用。

2.3 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠全血黏度及血漿黏度的影響 由表3可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠全血、血漿黏度均顯著增加(P<0.01)。滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組、滁菊總黃酮組、白背三七總黃酮組大鼠全血和血漿黏度均顯著降低，與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。但滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組、滁菊總黃酮組、白背三七總黃酮組3組間大鼠全血黏度和血漿黏度比較無顯著性差異(P>0.05)。

表1 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠體質量的影響

表2 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠FBG的影響

表3 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠全血及血漿黏度的影響

2.4 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠血沉及紅細胞壓積的影響 由表4可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血沉和紅細胞壓積增加(P<0.01)。與模型對照組比較，滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組、滁菊總黃酮組、白背三七總黃酮組大鼠血沉和紅細胞壓積顯著降低(P<0.01或P<0.05)。其中，滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍降低血沉和紅細胞壓積作用明顯強于滁菊總黃酮和白背三七總黃酮(P<0.01或P<0.05)。

表4 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠血沉及紅細胞壓積的影響

2.5 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠凝血參數的影響 由表5可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠凝血酶原時間明顯縮短(P<0.01)，纖維蛋白原水平顯著升高(P<0.01)，活化部分凝血酶時間、凝血酶時間顯著縮短(P<0.01)。與模型對照組比較，滁菊總黃酮+白背三七總黃酮、滁菊總黃酮、白背三七總黃酮均能顯著延長凝血酶原時間(P<0.01或P<0.05)，但3組間作用比較無顯著性差異(P>0.05)。滁菊總黃酮、白背三七總黃酮均能顯著降低纖維蛋白原，與模型對照組比較具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，且滁菊總黃酮+白背三七總黃酮降低纖維蛋白原作用顯著強于滁菊總黃酮(P<0.05)。滁菊總黃酮、白背三七總黃酮對活化部分凝血酶時間和凝血酶時間無顯著影響，但滁菊總黃酮+白背三七總黃酮能顯著延長活化部分凝血酶時間和凝血酶時間(P<0.05)。說明滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍抗凝血作用顯著強于單獨應用滁菊總黃酮、白背三七總黃酮。

表5 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠凝血參數的影響

2.6 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對ADP和AA誘導血小板聚集的影響 由表6可知，與正常對照組比較，模型對照組ADP和AA誘導的血小板聚集率顯著增加(P<0.01)。滁菊總黃酮+白背三七總黃酮組、滁菊總黃酮組和白背三七總黃酮組由ADP和AA誘導的血小板聚集率顯著低于模型對照組(P<0.01或P<0.05)，且滁菊總黃酮+白背三七總黃酮對ADP和AA誘導的血小板聚集的抑制作用顯著強于單獨應用滁菊總黃酮或白背三七總黃酮(P<0.01或P<0.05)。說明滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍在抑制ADP、AA誘導的血小板聚集方面具有協同作用。

表6 滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對ADP和AA誘導血小板聚集率的影響

3 討論

研究表明，糖尿病患者存在明顯的血液流變學異常，血液具有濃、黏、凝、聚等傾向，主要表現為全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積及血小板聚集性增高，紅細胞沉降速率加快等，血液流變學異常是導致糖尿病微血管并發癥的重要因素[12]。本實驗采用飼喂高脂飼料復合尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法復制2型糖尿病大鼠模型，再注射強的松龍和腎上腺素制備糖尿病血瘀證大鼠模型，結果表明，模型大鼠出現FBG顯著升高，全血黏度、血漿黏度及血沉、紅細胞壓積明顯增高，凝血時間明顯延長，纖維蛋白原水平顯著下降，血小板聚集性增強等變化，說明大鼠糖尿病血瘀證模型復制成功。

本實驗前期研究結果顯示，滁菊總黃酮40、20 mg/kg均能顯著改善糖尿病大鼠血液流變學異常，但40 mg/kg作用要強于20 mg/kg。白背三七總黃酮120 mg/kg、60 mg/kg均能顯著降低糖尿病大鼠血糖，但120 mg/kg的作用強于60 mg/kg。因此，本實驗確定采用滁菊總黃酮40 mg/kg和白背三七總黃酮120mg/kg配伍，觀察該配伍對糖尿病血瘀證大鼠血糖和血液流變學相關指標的影響。

全血黏度是反映血液流變學特性的宏觀指標，血漿黏度、紅細胞壓積及血沉等與全血黏度密切相關[13-14]。單獨應用滁菊總黃酮或白背三七總黃酮均能顯著降低模型大鼠全血和血漿黏度，降低血沉和紅細胞壓積。滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍降低血沉和紅細胞壓積作用顯著強于單獨應用滁菊總黃酮或白背三七總黃酮。

凝血參數是出血和血栓性疾病的常規檢驗項目，也是判斷藥物對內源性、外源性凝血因子和凝血共同通路影響的重要指標[15]。活化部分凝血酶時間主要反映內源性凝血系統狀況，其降低說明促凝物質進入血液及凝血因子的活性增高，血液處于高凝狀態；凝血酶原時間主要反映外源性凝血系統狀況，其縮短見于血液出現高凝狀態和血栓性疾病等；纖維蛋白原主要反映血液中纖維蛋白原的量，血栓栓塞性疾病會出現血液中纖維蛋白原量的增加；凝血酶時間主要反映纖維蛋白原轉為纖維蛋白的時間。本實驗研究結果表明，單獨應用滁菊總黃酮或白背三七總黃酮能延長凝血酶原時間，抑制ADP、AA誘導的血小板聚集，降低纖維蛋白原水平，但對活化部分凝血酶時間、凝血酶時間無顯著影響。滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍能顯著延長活化部分凝血酶時間、凝血酶時間，且降低纖維蛋白原作用顯著強于滁菊總黃酮；抑制ADP、AA誘導的血小板聚集作用顯著強于單獨應用滁菊總黃酮或白背三七總黃酮。說明滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍抗凝血、抑制血小板聚集作用顯著增強，其作用與影響內源性、外源性凝血因子有關。

本實驗從多個指標研究了滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍對糖尿病血瘀證大鼠血糖和血液流變學的影響，結果顯示滁菊總黃酮和白背三七總黃酮配伍在降血糖和改善血液流變學異常方面具有協同作用，但該配伍的作用機制有待進一步研究。

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