P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢中的表達變化及其與氧化應激的關系

彭 璇 陳宗海 嚴米婭 田 勇

(湖北民族學院醫學院病理學與病理生理學教研室，湖北 恩施 445000)

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P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢中的表達變化及其與氧化應激的關系

彭 璇 陳宗海 嚴米婭 田 勇1

(湖北民族學院醫學院病理學與病理生理學教研室，湖北 恩施 445000)

目的 研究P16蛋白在不同年齡小鼠卵巢組織中的表達變化及其與卵巢衰老過程中氧化應激的關系。方法 選用12、24、36、48周齡自然衰老C57BL/6小鼠為模型。通過測定8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量變化來反映卵巢組織氧化損傷程度。采用免疫組織化學方法分別檢測各組小鼠卵巢中P16蛋白、8-OHdG的表達和分布。結果 P16和8-OHdG在卵巢間質中均隨增齡表達增加，12周齡表達明顯低于其他各組(P<0.01)；48周齡與24周齡、36周齡分別進行比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)；而在各年齡組不同級別卵泡的顆粒細胞和卵母細胞中均未發現二者的表達。P16的表達和8-OHdG的表達呈正相關(r=0.998，P<0.01)。結論 P16蛋白在小鼠卵巢組織衰老過程中的表達呈上升趨勢，這種變化與卵巢氧化應激增加有關。

P16蛋白；8羥基脫氧鳥苷；氧化應激；衰老；卵巢

P16基因可以通過兩條相關的途徑來抑制腫瘤發生發展：一是通過促進DNA損傷的修復介導細胞周期的停滯，二是控制細胞內能引起DNA氧化損傷的活性氧簇(ROS)的募集〔1〕。自由基衰老理論提出機體ROS的大量募集可以攻擊生命大分子物質，使其功能發生改變，最終引起組織器官的功能減退或消失，即衰老的發生。但是卵巢的衰老有其自身的特點，其發生發展機制還未完全清楚。P16基因在調節氧化應激所致組織細胞衰老中發揮了重要的作用。另外自由基衰老理論提出活性氧自由基損傷組織器官中的DNA可以產生大量的8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，其含量可代表組織細胞中氧化損害嚴重程度，是目前公認的氧化損傷標志物之一〔2〕。而P16基因在卵巢中的表達及與自由基氧化損傷在卵巢衰老過程的相互作用尚不清楚。本研究探討P16和自由基DNA氧化損傷產物8-OHdG在卵巢中的表達變化及二者在卵巢衰老中的相互關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12、24、36、48周齡的雌性C57BL/6小鼠(北京華阜康生物科技有限公司提供，飼養于湖北民族學院醫學院SPF級動物房)，進行陰道涂片選取動情間期，以10%速眠新Ⅱ0.08 ml/g腹腔注射麻醉，偏背取正中切口，分離雙側卵巢，去包膜留取卵巢組織，4%多聚甲醛固定。

1.2 免疫組織化學染色 采用鏈霉親和素-生物素復合物技術(SP)法:卵巢組織經固定、脫水、石蠟包埋；常規脫蠟至水，PBS浸泡后3%過氧化氫孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min，抗原修復10 min，PBS洗3次，每次5 min，5%正常山羊血清37℃封閉30 min后加入兔P16單克隆抗體和小鼠8-OHdG單克隆抗體(美國Abcam公司ab62623)，4℃過夜，PBS洗3次后加入生物素標記的二抗，室溫孵育25 min，PBS洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，室溫孵育20 min，PBS洗3次，DAB顯色，充分沖洗后蘇木素復染，脫水，透明，封片,顯微鏡下觀察。

1.3 結果判讀 根據染色細胞所占面積和細胞染色強度兩項指標進行綜合評分判斷。染色細胞面積評分標準：0分染色細胞<5%；1分染色細胞5%～25%；2分染色細胞25.1%～50%；3分染色細胞50.1%～75%；4分染色細胞>75%。細胞染色強度評分標準：不顯色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深棕色3分。綜合評分=(染色細胞百分數+細胞染色強度分數)/2，0～0.5為(-)；0.6～1.5(+)；1.6～2.5為()；>2.5為()。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行秩和檢驗、Kruskal Wallis檢驗、Mann-Whitney檢驗，兩因素相關分析采用Spearman等級相關。

2 結 果

2.1 P16蛋白在卵巢組織中的表達 P16蛋白在卵巢中主要表達于圍繞卵泡周圍的間質，各級卵泡的顆粒細胞、卵泡膜細胞及卵母細胞中未見明顯表達，見圖1。卵巢間質細胞中的P16蛋白隨增齡其表達逐漸增強，各年齡組總體比較差異有統計學意義(P<0.05)；12周齡與其他各周齡分別比較差異均有統計學意義(P<0.01)；48周齡與其他各周齡比較差異均有統計學意義(P<0.01)；而24、36周齡組間進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 8-OHdG蛋白在卵巢組織中的表達 8-OHdG蛋白在卵巢中主要定位于間質，在24 w、48 w的始基卵泡和初級卵泡的顆粒細胞、卵泡膜細胞及卵母中可略見表達，而在次級卵泡和竇狀卵泡中未見明顯表達，見圖1。卵巢間質細胞中8-OHdG蛋白隨著年齡的增加其表達顯著增強，各年齡組總體比較差異有統計學意義(P<0.05)；12周齡與其他各周齡分別比較差異均有統計學意義(P<0.01)；48周齡與其他各周齡比較差異均有統計學意義(P<0.05)；而24、36周齡組間進行比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 P16蛋白和8-OHdG蛋白在卵巢組織中表達的相互關系 卵巢組織中P16蛋白表達-34例，+7例，14例，15例；8-OHdG蛋白表達-35例，+7例，15例，2例，卵巢組織中P16蛋白和8-OHdG蛋白的表達呈正相關(r=0.998，P<0.01)。

表1 P16蛋白在不同周齡小鼠卵巢間質的表達(n=15，n)

與12周齡組比較：1)P<0.05；與24周齡組比較：2)P<0.05，下表同

表2 8-OHdG蛋白在不同周齡小鼠卵巢間質的表達(n=15，n)

圖1 P16蛋白、8-OHdG蛋白在不同周齡小鼠卵巢組織中的表達變化(DAB，×400)

3 討 論

P16基因是一種抑癌基因，通過抑制CDK4/6活性，導致細胞周期停滯在G1期；同時P16蛋白的表達增加可以看作細胞衰老的一種標志。8-OHdG是ROS引起DNA氧化損傷的代謝產物，其表達的增加可以引起相應組織細胞的功能減退，加快衰老的發生，因此它可作為多種組織細胞衰老的標志物。體外研究結果顯示 P16蛋白表達增加與氧化應激所致造血干細胞、神經祖細胞、成纖維細胞，胰島細胞，血管內皮細胞的衰老密切相關〔2〕。另外，體內外各種傷害性刺激如氧自由基，電離輻射、紫外線等均能誘導P16蛋白的高表達，并且這些條件導致的P16蛋白表達的增加與多條細胞信號通路相關〔1，3〕。但是Adiam等〔4〕學者在禿頂患者皮膚乳頭細胞的研究發現氧化應激引起細胞衰老是通過P16/RB通路介導的；Choi等〔5〕學者還發現P16調節人類皮膚腫瘤細胞內氧化應激可以通過染色質重塑因子BRG1、 RAS-JNK-JUN-AP-1信號通路來調控。上述文獻提示通過P16調節ROS可能高度依賴于細胞所處的環境和細胞本身的功能狀態。

本研究結果顯示P16蛋白主要表達于卵巢間質，且隨增齡表達增加，而在顆粒細胞、卵母細胞以及卵泡膜細胞中表達甚少，未表現出增齡改變。Janzen等〔6〕發現隨著年齡的增加骨髓干細胞中的P16蛋白表達上調，并且其在調節干細胞的增殖和凋亡中發揮重要作用；Baker等〔7〕通過對高表達P16蛋白的細胞進行P16蛋白沉默之后，發現衰老細胞又重新恢復生理活性，衰老相關的表型也隨之減輕或者消失。Jinhwan等〔8〕報道，卵巢中氧化損傷產物在間質的表達隨增齡變化，同時發現其抗氧化酶基因隨增齡表達下降，這與本研究結果相一致。同時本研究顯示P16蛋白和8-OHDG蛋白在卵巢組織中的表達呈正相關。這些結果說明氧化損傷引起卵巢功能改變主要是引起間質的變化，而這種變化與P16蛋白的表達密切相關。Krishnamurthy等〔9〕報道P16蛋白隨增齡表達增加導致了前腦祖細胞和神經形成能力降低。但是P16蛋白在氧化應激引起卵巢衰老的過程中是通過何種途徑還不清楚。因此如果能找到一個復雜的抑制和激活P16蛋白關鍵調節點并加以適當調控可能是控制卵巢衰老發生的關鍵所在。目前在對P16基因的調控過程還沒有一個統一的定論，P16蛋白表達的調節是一個復雜的機制，它涉及外遺傳學控制和眾多的轉錄因子，核心蛋白復合體(PRC)1/2以及組蛋白脫乙?；冈谝种芇16蛋白的表達中都發揮了重要的作用〔10〕。因此我們推測P16蛋白高表達可能參與調節活性氧自由基引起的卵巢衰老過程，二者共同引起卵巢衰老的發生。而P16蛋白是如何調控卵巢衰老及在卵巢中P16蛋白表達受何種機制調控都應是以后研究的重點方向。

1 Jenkins NC,Liu T,Cassidy P,etal.The p16INK4A tumor suppressor regulates cellular oxidative stress〔J〕.Oncogene,2011；30(3):265-74.

2 Tabak O,Gelisgen R,Erman H.Oxidative lipid,protein and DNA damage as oxidative stress markers in vascular complications of diabetes mellitus 〔J〕.Clin Invest Med,2011;34(3):E163-71.

3 Ito K,Hirao A,Arai F,etal.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells〔J〕.Nat Med,2006；12:446-51.

4 Bahta AW,Farjo N,Farjo B,etal.Premature senescence of balding dermal papilla cells in vitro is associated with p16INK4a expression〔J〕.J Invest Dermatol,2008;128(5):1088-94.

5 Choi BY,Choi HS,Ko K,etal.The tumor suppressor p16INK4a prevents cell transformation through inhibition of c-Jun phosphorylation and AP-1 activity〔J〕.Nat Struct Mol Biol,2005;12:699-707.

6 Janzen V,Forkert R,Fleming HE,etal.Stem-cell ageing modied by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a〔J〕.Nature,2006；28：421-6.

7 Baker DJ,Wijshake T,Tchkonia T.Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders〔J〕.Nature,2011;479(7372):232-6.

8 Jinhwan L,Ulrike L.Oxidative damage increases and antioxidant gene expression decreases with aging in the mouse ovary 〔J〕.Biol Reprod Biol,2011;84(4):775-82.

9 Krishnamurthy J,Ramsey MR,Ligon KL,etal.p16INK4a induces an age-dependent decline in islet regenerative potential〔J〕.Nature,2006;443 (7110):453-7.

10 Yang DG,Liu L,Zheng XY.Cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a and telomerase may co-modulate endothelial progenitor cells senescence〔J〕.Ageing Res Revi,2008;7:137-46.

〔2015-05-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

1 恩施州中心醫院婦產科

彭 璇(1981-)，女，副教授，在讀博士，主要從事基因免疫的發生機制研究。

R310.4430

A

1005-9202(2016)19-4712-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.018